尼康顯微鏡：在光學(xué)顯微鏡的衍射障礙

光學(xué)顯微鏡發(fā)揮了核心作用，幫助理清復(fù)雜的生物學(xué)奧秘自從十七世紀(jì)荷蘭發(fā)明家安東尼凡列文虎克，英國科學(xué)家羅伯特·胡克首先報道分別使用單鏡頭及復(fù)合顯微鏡，觀察。在過去的三個世紀(jì)中，廣大的技術(shù)開發(fā)和制造的突破導(dǎo)致了顯著的*的顯微鏡設(shè)計(jì)，極大地提高了圖像質(zhì)量，以*小的像差。然而，盡管計(jì)算機(jī)輔助光學(xué)設(shè)計(jì)和自動化磨削方法用來制造現(xiàn)代的鏡頭組件，基于玻璃顯微鏡仍然阻礙征收可見光的波陣面的衍射光學(xué)分辨率極限，因?yàn)樗麄兺ㄟ^圓形在物鏡的后焦平面的光圈。其結(jié)果是，可達(dá)到的*高點(diǎn)至點(diǎn)的分辨率，可以用光學(xué)顯微鏡得到的，是由一組基本的物理定律，可以很容易地克服由物鏡或光圈設(shè)計(jì)合理交替。這些分辨率的限制通常被稱為衍射障礙，這限制了光學(xué)儀器的能力區(qū)分的兩個對象之間的橫向距離小于大約一半的光的波長，用于圖像試樣分離。

衍射的過程中涉及的光波的傳播時，與構(gòu)成一個典型試樣的錯綜復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。由于這樣的事實(shí)，在顯微鏡中觀察到的大多數(shù)試樣組成的高度重疊的功能，*好是表示的多個點(diǎn)光源，討論的描述代表一個單一的點(diǎn)光源的光通過波陣面通過顯微鏡衍射阻擋中心各種光學(xué)元件和光圈隔膜。正如下面將要討論的那樣，透射光或熒光發(fā)射波陣面所產(chǎn)生的衍射物鏡孔徑的邊緣顯微鏡檢體平面中的一個點(diǎn)，有效地傳播的波陣面，以產(chǎn)生圖像，綻開的點(diǎn)源有限的磁盤具有一個中央的衍射圖案，但較大的尺寸比原來的點(diǎn)。因此，由于光的衍射，檢體的圖像永遠(yuǎn)不會**地表示存在于試樣中的真實(shí)的細(xì)節(jié)，因?yàn)橛幸粋€下限，低于顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)不能解析。

除了發(fā)散光波在光學(xué)儀器中所發(fā)生的衍射現(xiàn)象，干擾的過程中描述的重組和求和的兩個或更多個重疊的波陣面。光的干涉也許是*普遍的現(xiàn)象，在光學(xué)顯微鏡和圖像形成的各個方面發(fā)揮著核心作用。在熒光或激光掃描共聚焦顯微鏡，物鏡的作用是集中到一個焦點(diǎn)的激發(fā)光的聚焦在試樣平面上的波前，以確保相長干涉。在此要求，建設(shè)性的干擾（下面討論），確保從所有可用的物鏡孔徑角入射的波陣面的電場矢量駐留在相同的相位，因此產(chǎn)生*小的可能的激勵點(diǎn)。

這兩個干涉和衍射，這實(shí)際上是表現(xiàn)為相同的過程，是負(fù)責(zé)創(chuàng)建在中間像平面在顯微鏡試樣的實(shí)像。簡單地說，兩個波陣面之間的干擾的發(fā)生，此外，如果波是**的相（建設(shè)性的干擾）的振幅的兩倍，但波互相抵消時完全出了180度的相位（稱為破壞性干擾，但大多數(shù)發(fā)生干擾介于兩者之間）。光子的能量光波固有本身不是一倍，或全軍覆沒兩波干擾時，而這種能量在允許建設(shè)性的干擾方向的衍射和干涉。因此應(yīng)被視為涉及光波和光子能量的再分配現(xiàn)象，干涉和衍射。

A點(diǎn)對象中的顯微鏡，如熒光的蛋白質(zhì)單分子，產(chǎn)生圖像干擾的作用產(chǎn)生的衍射圖案由上面的中間平面。當(dāng)高度放大的，觀察到的點(diǎn)對象的衍射圖案包括一系列的衍射環(huán)所包圍的一個中心位置（衍射磁盤）（參見圖1）。在與衍射理論的命名法中，明亮的中心區(qū)域被稱為環(huán)的零級衍射點(diǎn)，而被稱為*，第二，第三，等等，為了衍射環(huán)。當(dāng)顯微鏡是正確的集中，在極小環(huán)之間的光的強(qiáng)度是零。相結(jié)合，這點(diǎn)光源的衍射圖樣被稱為的艾里磁盤（喬治爵士后B.艾里，十九世紀(jì)英國天文學(xué)家）。的大小的艾里圖案的中心的位置，相關(guān)的光的波長和物鏡的孔徑角。顯微鏡的物鏡，孔徑角所描述的數(shù)值孔徑（NA），其中包括了長期的罪θ，*過該物鏡可以收集來自試樣的光的角的一半。在分辨率方面，在橫向衍射艾里斑的半徑（Y）圖像平面是由下式定義：

阿貝分辨率_X，：Y =λ/2NA （1）。

其中，λ是照明的透射光或熒光的激發(fā)波長頻帶的平均波長。的物鏡的數(shù)值孔徑（NA =sin（θ））由成像介質(zhì)的折射率（N，通常是空氣，水，甘油，或油）的孔徑角的正弦值乘以（sin（θ）被定義）。其結(jié)果是在此關(guān)系中，由一個點(diǎn)光源產(chǎn)生的光斑的大小隨波長和增大數(shù)值孔徑減小，但始終保持有限直徑的磁盤。因此，圖像產(chǎn)生的具有綠光（550納米）的數(shù)值孔徑為0.90的100倍放大倍率的物鏡的光點(diǎn)尺寸是約30微米，而通過100x物鏡的數(shù)值孔徑1.4的光點(diǎn)尺寸是約200納米，近50 ％較小。衍射極限分辨率的理論在1873年由德國物理學(xué)家恩斯特·阿貝墊付（見公式（1） ），后來提煉瑞利勛爵在1896年（ 方程（3） ），以必要的兩個艾里圖案之間分離，以定量措施區(qū)分它們作為獨(dú)立的實(shí)體。

阿貝分辨率_? =2λ/NA ² （2）

根據(jù)阿貝的理論，圖象是由具有不同強(qiáng)度的衍射限制的點(diǎn)重疊，以生成*終的結(jié)果，如上所述的從數(shù)組中。因此，優(yōu)化的空間分辨率和圖像的對比度的*機(jī)制是通過減少成像波長，增大數(shù)值孔徑，或使用具有較大的折射率的成像介質(zhì)的衍射限制的點(diǎn)的大小*小化。然而，在理想條件下具有***的物鏡，橫向分辨率仍然有限相對溫和的水平，由于傳輸特性的影響玻璃接近200至250毫微米（見公式（1） ），在波長400納米下的數(shù)值孔徑的物理約束。與此相反，在艾里斑的軸向尺寸，通常被稱為的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）形成一個橢圓形的圖案。沿著光軸的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的幾何形狀的細(xì)長來自非對稱的波陣面，從顯微鏡物鏡的性質(zhì)。在光學(xué)顯微鏡軸向分辨率甚至不如橫向分辨率（公式（2）中所概述），500納米的順序。當(dāng)試圖高度曲折的圖像的功能，如細(xì) 胞器，衍射限制的分辨率表現(xiàn)為不良軸向切片能力，并降低對比度在成像平面上。此外，整體實(shí)現(xiàn)三維標(biāo)本的標(biāo)本的對比焦點(diǎn)外的光的干涉的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的發(fā)生是由于相對較差的軸向分辨率一般是占主導(dǎo)地位的。

圖1中所示的衍射斑的大小在一個典型的光學(xué)顯微鏡物鏡孔徑角的效果。示出的點(diǎn)源和它的共軛（P）在圖像平面的波陣面會聚，并進(jìn)行建設(shè)性干涉的物鏡具有較大（圖1（a）段）和?。▓D1（b））的數(shù)值孔徑。的點(diǎn)P1在焦平面上橫向移動，直到在一定的距離的相消干涉（取決于物鏡的數(shù)值孔徑）定義的位置的的*衍射*低的，因此衍射點(diǎn)的半徑。對于高分辨率的配置在圖1（a），分甲和乙的波陣面產(chǎn)生10任意單位定義成像光斑尺寸更小的光斑尺寸。與此相反，在圖1（b）的較低分辨率的配置，降低孔徑角增加甲和乙至18任意單元之間的距離。換言之，由熒光團(tuán)發(fā)射的光（點(diǎn)光源）移動同樣的距離的波陣面到達(dá)在影象平面上的相位和干涉產(chǎn)生具有高強(qiáng)度的光點(diǎn)在圖像平面上的物鏡聚焦。相消干涉，從而導(dǎo)致強(qiáng)度為零，所產(chǎn)生的波陣面到達(dá)分之一波長的相位（見上面的討論）。由于強(qiáng)度下降是逐漸現(xiàn)貨沿著橫向軸線，將出現(xiàn)兩個點(diǎn)源（或熒光分子）緊密聯(lián)系起來的光斑的大小是一個單一的，較大的光斑和未解決的。

如上所述，在三維空間中的艾里斑的光強(qiáng)分布是指作為一個點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和完整地描述了一個點(diǎn)光源的光的衍射圖案的（例如作為一個單一的熒光基團(tuán)）在橫向 ( x , y ) 修改受衍射限制的光學(xué)顯微鏡的軸向（z）的尺寸。點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的大小來確定成像光的波長的特性的物鏡（數(shù)值孔徑）和成像介質(zhì)的折射率。分辨率，在實(shí)際意義上，通常被定義為*小之間的間隔距離的兩個點(diǎn)狀的物體中，仍可以將它們作為單獨(dú)的發(fā)射器（未合并成一個單一的點(diǎn)）區(qū)別。其結(jié)果是，大多數(shù)的分辨率標(biāo)準(zhǔn)（例如，瑞利判據(jù)，麻雀限制，或*大值一半處的全寬度，半峰全寬）直接相關(guān)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的性質(zhì)和幾何形狀。

Rayleigh分辨率_X，：Y =0.61λ/NA （3）

根據(jù)瑞利判據(jù)，在顯微鏡中觀察到的兩個點(diǎn)源被視為被解決時的艾里斑的光點(diǎn)中心的主要衍射峰（見圖2）從一個點(diǎn)源與**小重疊（暗區(qū)域圍繞中央的艾里斑）等點(diǎn)源。如果兩個艾里磁盤或點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)之間的距離大于該值，這兩個點(diǎn)源被認(rèn)為是要解決（和可以很容易地加以區(qū)別）。否則，艾里磁盤合并在一起，被認(rèn)為是不被解決。其他條款中所述，瑞利判據(jù)被滿足的時候，兩個緊密間隔的點(diǎn)源的圖像之間的距離的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的寬度是約等于。相比之下，兩個點(diǎn)源的圖像不再有浸在中央峰之間的亮度，而是表現(xiàn)出恒定的亮度，跨區(qū)域之間的峰之間的距離被定義為Sparrow分辨率極限。Sparrow分辨率極限是阿貝值的大約三分之二（公式（4） ）的瑞利分辨極限。

Sparrow分辨率_X，：Y =0.47λ/NA （4）

圖2給出了瑞利判據(jù)的兩個緊密定位的點(diǎn)聲源的側(cè)向和軸向尺寸的圖形表示。在圖2（a）中，點(diǎn)源的強(qiáng)度表示固體藍(lán)色，黃色虛線的曲線。的合并點(diǎn)源產(chǎn)生的位移沿縱坐標(biāo)為清楚起見，一個紅色的曲線表示的總強(qiáng)度。為了區(qū)分這些點(diǎn)源，峰之間的距離應(yīng)足以產(chǎn)生，取值范圍在20和30％的強(qiáng)度的峰值（圖2（a））的強(qiáng)度*小。同樣的標(biāo)準(zhǔn)適用于的軸向尺寸（圖2（b））。請注意，分辨率（在圖2（a）和圖2（b）沿橫坐標(biāo)表示）是沿z軸的顯著較低的。

雖然瑞利判據(jù)和類似措施是有效分辨率壓力表觀察的標(biāo)本，仍然有幾個缺點(diǎn)，這樣的定義分辨率。例如，在研究者注意，兩個粒子合并，以形成一個單一的點(diǎn)圖像的情況下，計(jì)算機(jī)算法可以適用于區(qū)分的粒子以任意小的距離。確定兩個相鄰的粒子的精確位置，然后就變成了實(shí)驗(yàn)精度的問題，而不是所描述的瑞利限制決定的光子統(tǒng)計(jì)。此外，分辨率的限制并不一定對應(yīng)的細(xì)節(jié)，可以在圖像中觀察到的水平。雖然瑞利極限的距離被定義為從**小值的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中心，這個值可以被呈現(xiàn)的*的光學(xué)系統(tǒng)或線性光學(xué)小。分辨率標(biāo)準(zhǔn)，也不要依賴于燈是一種衍射波陣面構(gòu)成一定的限制的詳細(xì)程度，實(shí)際上是包含在浪的事實(shí)。

分辨率阿貝方程避免瑞利判據(jù)和麻雀限制的缺點(diǎn)，但有一個更間接的解釋。可成像的過程中，在顯微鏡中的樣本之間的照明和熒光發(fā)射（或透射光）的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的卷積運(yùn)算。被進(jìn)行傅立葉變換（參見圖3）后，在顯微鏡觀察對象（無論它們是周期性的或不）都可以被*地描述為眾多具有不同空間頻率的正弦曲線的總和。需要注意的是檢體的圖像，存在于所有的共軛像平面，存在的傅里葉變換在更高的頻率代表細(xì)標(biāo)本細(xì)節(jié)和較低的頻率代表粗細(xì)節(jié)（圖3（a））中的相應(yīng)的孔的平面。這點(diǎn)與物鏡后孔中的波形，圖3（b）中示出。較低的空間頻率位于光圈的中心附近，而頻率接近的孔的邊緣的區(qū)域逐漸增大。

在實(shí)際空間中的卷積的概念可以容易地通過檢查在傅立葉空間中的等效操作簡化。在后者中，可以乘以變換的對象，得到?jīng)]有噪聲的理想圖像的傅立葉變換的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的傅里葉變換。點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的傅立葉變換后，描述了每個試樣的空間頻率如何有效地被轉(zhuǎn)移到*終的圖像。因此，在傅立葉變換后的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)是指作為光學(xué)傳遞函數(shù)（OTF，請參閱圖3（b））。OTF定義在何種程度上含有標(biāo)本信息丟失的空間頻率，保留，減毒，或在成像過程中的相移。在成像過程中丟失的空間頻率信息，無法恢復(fù)，所以各種形式的顯微鏡的主要物鏡之一是盡可能獲得*高的頻率范圍為標(biāo)本。在每個空間頻率的OTF（測量在振蕩每米）的值是一個有用的指標(biāo)，來描述一個特定的正弦對象特征的對比度達(dá)到在*終圖像中。

要記住的光學(xué)顯微鏡的重要口岸之一是檢測光學(xué)傳遞函數(shù)的特征頻率，作為一項(xiàng)決議，“截止”邊框（阿貝極限頻率;參見圖3（b））。在圖像中不存在記錄，可通過在顯微鏡高于限值的頻率。的*高空間頻率的峰到峰的距離，因此，能夠通過的物鏡（在圖3中的波形為綠色（一））的值e阿貝限制，這是更正式的定義為通常被稱為在一個結(jié)構(gòu)中，可以在*終圖像中檢測到的*小的周期。由于這樣的事實(shí)，一個點(diǎn)光源發(fā)出或傳送的空間頻率范圍廣泛，阿貝限制也必須跨越三個維度中的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。

結(jié)論

傳統(tǒng)的廣角鏡產(chǎn)生圖像捕捉光線在不同的地點(diǎn)在物鏡上進(jìn)一步加工的波陣面為通，通過光的火車，終于干擾在圖像平面的點(diǎn)源。其結(jié)果是在光學(xué)的互易原理，阿貝限制在顯微鏡的橫向軸線的兩波干擾的物鏡捕獲在*極端的角度，可以通過以下方式獲得的*大的*大距離相對應(yīng)。的阿貝分辨率極限是有吸引力的，因?yàn)樗鼉H依賴于離開試樣的物鏡捕獲的不同的波陣面之間的*大相對角度。此限制，因此介紹的*小級別的細(xì)節(jié)，都不可能進(jìn)行成像，并周期性結(jié)構(gòu)具有較高的空間頻率（波長較短）將不會傳送到圖像。

即使在用光學(xué)顯微鏡配有可用的*高質(zhì)量的透鏡元件，是完全一致的，并具有*高的數(shù)值孔徑的情況下，分辨率仍僅限于大約一半的光的波長在*好的情況下。在實(shí)踐中，通常實(shí)現(xiàn)在常規(guī)成像的分辨率往往達(dá)不到衍射的物理限制。這是由于這樣的事實(shí)，在試樣的光學(xué)不均勻性可以激發(fā)光束的相位失真，導(dǎo)致一個重點(diǎn)的體積明顯大于衍射限制的想法。此外，分辨率也可以通過使用不兼容的浸油損害，蓋玻片具有的*佳范圍以外的厚度，調(diào)整不當(dāng)校正鋌。

已被廣泛使用激光掃描共聚焦和多光子顯微鏡適度提高沿橫向和軸向的軸的空間分辨率，但這些技術(shù)仍然有限的方面實(shí)現(xiàn)顯著改善。加上針孔限制在共聚焦顯微鏡檢測的聚焦激光激發(fā)，在原則上，由1.4倍提高空間分辨率，雖然這只有在信號與噪聲在一個顯著的成本實(shí)現(xiàn)。同樣地，多光子熒光顯微鏡利用非線性吸收過程，以減少有效的激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的大小。但是，再次，更小和更精細(xì)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)被抵消的必要性，使用較長波長的激勵光。作為一個結(jié)果，而不是提供顯著改善的分辨率，共聚焦和多光子顯微鏡比傳統(tǒng)的廣角技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是減少排放源的焦平面（焦亮），使去除背景信號源自三維容積重建成像方式獲得清晰的光學(xué)部分。

由物理定律支配光學(xué)顯微鏡的分辨率限制，可以*過，但是，通過利用法律的“漏洞”，強(qiáng)調(diào)的事實(shí)是真實(shí)的，只有在一定的假設(shè)下的局限性。存在特別重要的三個假設(shè)分辨率標(biāo)準(zhǔn)的評估過程中發(fā)揮作用，包括常規(guī)的幾何形狀，其中所收集的物鏡，整個試樣的激勵光的均勻性，線性特性（吸收和發(fā)射）的熒光光涉及單個光子。簡單地說，通過收集周圍的試樣或使用隨位置而變化的激勵光的光在一個較大的角度，可以提高分辨率。使用熒光的過程，涉及兩個或兩個以上的光子在一個非線性的方式，也可以分解的衍射屏障。