徠卡顯微鏡，F(xiàn)LCS - 熒光相關(guān)光譜進展
在單分子水平的表征物質(zhì)已成為的標準劇目科研院所的一部分。*常用的方法之一，是熒光相關(guān)光譜（FCS），它可以用來檢查的動態(tài)性和在溶液中的熒光分子濃度。本文介紹了一種測量技術(shù)，結(jié)合了經(jīng)典的FCS測量與時間相關(guān)的單光子計數(shù)，以獲得更精確和可靠的結(jié)果。
FCS是經(jīng)常被用來研究的分子在溶液中的動態(tài)過程。然而，實驗因素嚴重影響的分析，如FCS數(shù)據(jù)記錄。典型的因素包括工件的測量系統(tǒng)中，雜散光的熒光基團的三線態(tài)，雜質(zhì)或背景的樣品。由于這些因素不是恒定的，但樣本間差別很大，一個FCS實驗的分析往往是問題，而且容易出錯。因此，*好是根據(jù)物理定律，然后再執(zhí)行一個特定的數(shù)據(jù)分析來清潔數(shù)據(jù)記錄。
遵循一個明確的數(shù)學分布概率的物理值，熒光衰減。這里所描述的方法，熒光壽命相關(guān)光譜（FLCS）使用清潔FCS數(shù)據(jù)集的熒光衰減行為。FLCS可以使用，例如，以消除工件的測量系統(tǒng)或單獨的數(shù)據(jù)記錄從一些熒光基團的混合物，然后可以逐個進行分析。這種類型的評估產(chǎn)生明確和可重復(fù)性的結(jié)果，即使是*小的熒光濃度。
單分子光譜
在七十年代推出的熒光相關(guān)光譜的原理描述了在橢球體積溶液中單分子熒光研究。結(jié)合共聚焦顯微鏡，，F(xiàn)CS已成為一個重要的測量方法，為研究分子動力學和濃度。
在一個FCS的實驗中，典型的連續(xù)的激勵光聚焦到一個點在紙巾或溶液。通過使用共聚焦設(shè)置時，可以觀察到分子內(nèi)的體積為約0.3毫微微升（圖1A）。此卷是由激發(fā)和發(fā)射波長，客觀和共焦針孔的大小。
實驗本質(zhì)上是基于布朗運動的分子擴散通過檢測量，很高興和發(fā)光。測量的對象是由此產(chǎn)生的熒光強度隨時間的變化（圖1B），然而，可能的影響，以及由其他光物理過程。
分析FCS的數(shù)據(jù)的*個步驟是從測得的熒光強度，計算出的自相關(guān)。然后，一個合適的模型函數(shù)的變參數(shù)裝配到所得到的自相關(guān)函數(shù)（ACF），從其中，例如，所產(chǎn)生的熒光團濃度或擴散常數(shù)。ACF進行分析時，所面臨的挑戰(zhàn)是找到一個合適的模型描述不僅實際性能的熒光，也影響實驗因素與可變參數(shù)函數(shù)。每個額外的影響需要至少一個附加的參數(shù)的復(fù)雜性和分析的傾向，因此，包含錯誤增加。如果樣品有一個以上的熒光基團，每個熒光團的擴散行為影響所得的ACF，這不是一個簡單的線性組合的情況，而是一個復(fù)雜的各個信號的疊加。
圖 1：插圖的FCS實驗。（A）測量體積（深藍色）的聚焦激光束在聚焦。（B）上記錄一個FCS數(shù)據(jù)記錄和計算的自相關(guān)函數(shù)的熒光強度的波動的。
不同的方法
多年來，已經(jīng)建立了各種版本的FCS來處理的與ACF的分析相關(guān)聯(lián)的問題。所有這些方法的目的是清潔背景工件的數(shù)據(jù)，并允許同時研究一些熒光的分子。
*常用的方法是熒光互相關(guān)光譜法（FCCS），在其中的熒光，同時記錄與兩個檢測器。探測器后脈沖的*常見的實驗工件之一，例如，可以消除與FCCS。這是一個的幻像脈沖發(fā)生在檢測器的反饋所造成的在測量過程中。分配相等的部分所發(fā)射的光子在兩個檢測器上，然后從兩個數(shù)據(jù)記錄計算出的互相關(guān)的干擾信號被刪除。
FCCS還允許具有不同的光譜發(fā)射波長的熒光團分離，從而使單獨的數(shù)據(jù)分析用于確定擴散常數(shù)和濃度。除此之外，交叉的兩個信號的相關(guān)性提供了一個潛在的相互作用的分子受調(diào)查的信息。然而，實驗裝置的復(fù)雜性，不應(yīng)該被低估。單獨檢測的熒光基團的檢測量有重疊的100％，這是由于檢測音量大小的激發(fā)和發(fā)射波長的依賴性非同小可。此外，*光譜分離的熒光可以經(jīng)常不實現(xiàn)，這反過來又使數(shù)據(jù)記錄的分析更加困難。
數(shù)學的其他方式的數(shù)據(jù)分開，實例中的擴散系數(shù)的差別的基礎(chǔ)上。然而，必須不同的分子的擴散系數(shù)（至少）1.6，得到有用的結(jié)果的一個因素。因此，這種測量方法并不分子濃度或擴散常數(shù)進行簡單的閱讀，而是基于高度復(fù)雜的數(shù)學擬合的ACF，包括假設(shè)一般不可能通過實驗證明，因此極其容易出錯。
通過時間相關(guān)的單光子測量的改進
熒光壽命相關(guān)光譜的方法，可以規(guī)避上述問題。FLCS實驗中，不僅熒光強度的時間變化，而且還有具體的一個脈沖激發(fā)后的熒光基團的熒光衰減行為的測量，然后用于清洗的FCS數(shù)據(jù)記錄。FLCS，而不是假設(shè)的測定數(shù)據(jù)的分析，基于純數(shù)學的評價方法。
基本上，F(xiàn)LCS FCS和時間相關(guān)單光子計數(shù)（TCSPC），這是*適合的方法，用于測量單個分子的熒光衰減行為的組合。TCSPC需要的脈沖激勵激光器和單光子靈敏的檢測器。
實驗原理
對于FLCS實驗，TCSPC測量是在一個特殊的“時間標記的時間分辨”（TTTR）測量模式。在這里，兩個相互獨立的為每個檢測到的光子的時間的測量：首先，在激勵脈沖的發(fā)病和到達的檢測器信號（微觀到達時間）以皮秒分辨率，其次從實驗開始時的時間之間的時間注冊的特定的光子（宏觀到達時間）。
的微觀的到達時間被用來產(chǎn)生一個的TCSPC直方圖，描述了特定的熒光衰減行為。就像在任何經(jīng)典FCS實驗宏觀到達時間可以用來計算出的熒光強度隨時間的變化，并確定通過計算的ACF的擴散系數(shù)和濃度。
對于一個FCS的實驗中，熒光團的混合物連續(xù)激發(fā)，也有一定的概率為每個檢測到的單光子發(fā)射的熒光團或熒光基團B.這個概率是恒定的時間，因為沒有定義的時刻激發(fā)。FLCS是基于一個簡單的事實脈沖激發(fā)產(chǎn)生激發(fā)一個特定的時間，這意味著一個光子所發(fā)出的熒光基團A或熒光基團乙變化的時候（圖2A）的檢測概率。檢測到的光子激發(fā)后不久可能發(fā)射的更快的衰減的熒光基團（壽命變短），，而晚光子更有可能被發(fā)射的速度較慢的衰減熒光團（更長的壽命）。隨時間變化的檢測概率的基礎(chǔ)上，有數(shù)學方法可以應(yīng)用到統(tǒng)計概率原產(chǎn)概率分配的過濾器，每個光子的到達時間（圖2B）。
圖 2：（A）兩個熒光基團的熒光衰變行為A（紅色）和B（藍色）以及混合物（黑色）。（B）分配給每個光子的到達時間與從熒光團發(fā)射的光子的概率統(tǒng)計濾波功能A（紅色）或B（藍色）。
要設(shè)置一個合適的分配濾波器，對應(yīng)的直方圖的構(gòu)成成分是必需的，除了TCSPC測量本身的直方圖。如果，例如，人們希望分開的熒光基團，TCSPC直方圖純熒光團是必要的。要刪除不帶熒光基團的雜散光成分的測量，一個額外的測量是必要的。分布過濾器，然后分配給每個光子的光子的概率來源于特定組件的抵達時間。因此，此數(shù)據(jù)分離發(fā)生在單光子水平。分離的數(shù)據(jù)記錄可以彼此獨立地進行分析計算ACF。
這種類型的統(tǒng)計分析不僅適用于所檢測的熒光團的排放量，但同樣適合用于描述工件的測量系統(tǒng)，例如暗計數(shù)率和后脈沖檢測器（圖3A）。關(guān)于這一主題的文學已經(jīng)包含了成功的例子分裂的測量數(shù)據(jù)記錄到多達4個的子組件。
一般來說，它是重要的，F(xiàn)LCS要注意的是使用分離的和整個熒光衰減行為，可確定從它的平均熒光壽命。可以在數(shù)學上彼此分開的熒光基團或組件，如果他們顯示在的TCSPC直方圖的不同的配置文件。
示例應(yīng)用
的功能性，有效性和穩(wěn)定性的FLCS方法已被證明在極其廣泛的應(yīng)用范圍，不僅在體外而且在體內(nèi)。即使在簡單的分析只有非常小的熒光染料濃度的FCS的實驗中，使用FLCS導致更高的精度和再現(xiàn)性分子濃度和擴散速度的測量。圖3示出FLCS測量的染料Atto655，溶解在乙二醇。由于大的雜散光成分在低摩爾的解決方案中，只有約60％的檢測到的光子起源從染料，其中所確定的熒光團濃度有負面影響。在比較有和沒有生命周期的濾波的數(shù)據(jù)分析的自相關(guān)曲線（圖3C），可以看出，通過消除測量的背景，其中包含雜散光系統(tǒng)構(gòu)件（圖3A 和圖3B ，紅色線），遠小的分子數(shù)被檢測到，構(gòu)成設(shè)定的分子溶液的濃度（下午10點）的良好近似。該方法也被體內(nèi)的小區(qū)的測量，其中FLCS用于去除來自數(shù)據(jù)記錄 在單元格中存在的黃酮類和NADH分子施加巨大的成功。
在法國巴黎狄德羅大學的的實驗室Ma?té酒店Coppey穆瓦桑*近能夠證明，它也有可能在體內(nèi) FCCS實驗，以除去在與熒光蛋白GFP和mCherry的的mCherry檢測通道中的綠色熒光蛋白的光譜串擾。在這里，在GFP激發(fā)用脈沖激光和連續(xù)波激光的mCherry。這使一種蛋白質(zhì)相互作用研究的ACF沒有數(shù)學擬合。
圖 3：FLCS實驗系統(tǒng)特定的測量工件內(nèi)的影響和消除。（A）的TCSPC直方圖染料的Atto655的溶于乙二醇（黑色）10日下午，在水（100分，藍）和背景（紅色），純Atto655的。（B）的統(tǒng)計過濾功能分配給每個光子的到達時間的光子來源于熒光團（藍色）或背景（紅）的概率。發(fā)射Atto655檢測到的光子的概率增加的延遲時間越長。（C）的自相關(guān)函數(shù)（黑色）和（紅色）壽命過濾FCS數(shù)據(jù)集的記錄。
總結(jié)
FLCS是一個復(fù)雜的方法確定分子的濃度和動力學。由于其物理法，熒光衰減行為，或許可以用一個統(tǒng)計分布的概率，這是很有用的分離的測量數(shù)據(jù)和清洗工件的FCS數(shù)據(jù)記錄。FLCS從而使分子的濃度和擴散時間更精確和可重復(fù)的決心。這反過來又導致生成的數(shù)據(jù)之間的可比性，不同的測量系統(tǒng)之前，現(xiàn)在這是不可能的。