顯微鏡分類和工作原理
顯微鏡是觀察細(xì)胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源。
—、光學(xué)顯微鏡
（一）、普通光學(xué)顯微鏡
普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成，即：①照明系統(tǒng)，包括光源和聚光器；②光學(xué)放大系統(tǒng)，由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成；③機(jī)械裝置，用于固定材料和觀察方便（圖2-1）。
圖2-1 尼康E-600顯微鏡
顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨力（resolution）有關(guān)，分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目標(biāo)25cm處）能分辨物體*小間隔的能力，分辨力的大小決定于光的波長和鏡口率以及介質(zhì)的折射率，用公式表示為：
式中：n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口的張角），N.A.=鏡口率（numeric aperture）。鏡口角總是要小于180?，所以sina/2的*大值必然小于1。
制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65～1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。對(duì)于干燥物鏡來說，介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.05～0.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。
普通光線的波長為400～700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值不會(huì)小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設(shè)計(jì)的*大放大倍數(shù)通常為1000X。
（二）、熒光顯微鏡
細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡（圖2-2，3，4）就是對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。
圖2-3 落射式照明原理
熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：
1、照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上（圖2-3）；
2、光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；
3、有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。
圖2-4 熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）
（三）、激光共聚焦掃描顯微鏡
圖2-5 激光共聚焦掃描顯微鏡
圖2-6 LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管
激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope，圖2-5、6）用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。
激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測(cè)量。
（四）、暗視野顯微鏡
暗視野顯微鏡（dark field microscope，圖2-7）的聚光鏡中央有當(dāng)光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。
圖2-7 暗視野照明方式
（五）、相差顯微鏡
相差顯微鏡（phasecontrast microscope，圖2-8、9）由P．Zernike于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎(jiǎng)。這種顯微鏡*大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。
相差顯微鏡的基本原理是，把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個(gè)特殊之處：
1、環(huán)形光闌（annular diaphragm）位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。
2、相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：
?、貯+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。
?、?B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。
圖2-8 相差顯微鏡照明原理
圖2-9 一種介殼蟲的染色體（PCM照片）
（六）、偏光顯微鏡
偏光顯微鏡（polarizing microscope）用于檢測(cè)具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。和普通顯微鏡不同的是：其光源前有偏振片（起偏器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（一個(gè)偏振方向與起偏器垂直的的起偏器），這種顯微鏡的載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn)的，當(dāng)載物臺(tái)上放入單折射的物質(zhì)時(shí)，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)，由于兩個(gè)偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時(shí)，由于光線通過這類物質(zhì)時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)便能檢測(cè)到這種物體。
（七）、微分干涉差顯微鏡
1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明了微分干涉差顯微鏡（differential interference contrast microscope）。DIC顯微鏡又稱Nomarski相差顯微鏡（Nomarki contrast microscope），其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。
DIC顯微鏡的物理原理完全不同于相差顯微鏡，技術(shù)設(shè)計(jì)要復(fù)雜得多。DIC利用的是偏振光，有四個(gè)特殊的光學(xué)組件：偏振器（polarizer）、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器（analyzer）。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中則安裝了石英Wollaston棱鏡，即DIC棱鏡，此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y），二者成一小夾角。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。*初兩束光相位一致，在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同，引起了兩束光發(fā)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個(gè)Wollaston棱鏡，即DIC滑行器，它把兩束光波合并成一束。這時(shí)兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。*后光束穿過第二個(gè)偏振裝置，即檢偏器。在光束形成目鏡DIC影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉。x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0時(shí)，沒有光穿過檢偏器；光程差值等于波長一半時(shí)，穿過的光達(dá)到*大值。于是在灰色的背景上，標(biāo)本結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出亮暗差。為了使影像的反差達(dá)到*佳狀態(tài)，可通過調(diào)節(jié)DIC滑行器的縱行微調(diào)來改變光程差，光程差可改變影像的亮度。調(diào)節(jié)DIC滑行器可使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，通常是一側(cè)亮，而另一側(cè)暗，這便造成了標(biāo)本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕（圖2-10）。
圖2-10 DIC顯微鏡下的硅藻（偽彩色）
DIC顯微鏡使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，特別是一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強(qiáng)，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。
（八）、倒置顯微鏡
組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上（圖2-11），用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。
圖2-11 萊卡倒置顯微鏡
進(jìn)入20世紀(jì)80年代以來，光學(xué)顯微鏡的設(shè)計(jì)和制作又有了很大的發(fā)展，其發(fā)展趨勢(shì)主要表現(xiàn)在，注重實(shí)用性和多功能方面的改進(jìn)。在裝配設(shè)計(jì)上趨于采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體，從而操作靈活，使用方便。
二、電子顯微鏡
（一）、透射電子顯微鏡
1、基本原理
在光學(xué)顯微鏡下無法看清小于0.2μm的細(xì)微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopic structures）或*微結(jié)構(gòu)（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM），電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。
電子顯微鏡（圖2-12）與光學(xué)顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是前者用電子束作光源，用電磁場(chǎng)作透鏡。另外，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的*薄切片。這種切片需要用*薄切片機(jī)（ultramicrotome）制作。電子顯微鏡的放大倍數(shù)*高可達(dá)近百萬倍、由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。
圖2-12 JEM-1011透射電子顯微鏡
2、制樣技術(shù)
1）*薄切片
通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式推進(jìn)樣品切片（圖2-13），切片厚度20~50nm，切片采用重金屬鹽染色，以增大反差（圖2-14）。
圖2-13 萊卡*薄切片機(jī)
圖2-14 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖（偽彩色）
2）負(fù)染技術(shù)
負(fù)染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對(duì)鋪展在載網(wǎng)上的樣品進(jìn)行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果（圖2-15），分辨力可達(dá)1.5nm左右。
圖2-15 肌動(dòng)蛋白纖維的負(fù)染電鏡照片
3）冰凍蝕刻
冰凍蝕刻（freeze-etching）亦稱冰凍斷裂（freeze-fracture）。標(biāo)本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，進(jìn)行冰凍。然后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結(jié)構(gòu)，稱為蝕刻（etching）。蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強(qiáng)反差和強(qiáng)度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜（replica）。復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形態(tài)，在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的結(jié)構(gòu)（圖2-16）。
圖2-16冰凍蝕刻電鏡照片
（二）、掃描電子顯微鏡
圖2-17 JEOL掃描電子顯微鏡
掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM，圖2-17、18、19）于20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。其工作原理是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級(jí)電子由探測(cè)體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級(jí)電子信號(hào)。
目前掃描電鏡的分辨力為6～10nm，人眼能夠區(qū)別熒光屏上兩個(gè)相距0.2mm的光點(diǎn)，則掃描電鏡的*大有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。
圖2-18 光學(xué)顯微鏡、TEM、SEM成像原理比較
圖2-19 人類血細(xì)胞SEM照片
（三）、掃描隧道顯微鏡
掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope，STM）由Binnig等1981年發(fā)明，根據(jù)量子力學(xué)原理中的隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)。當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個(gè)納米的高度上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV～2V），針尖與樣品之間產(chǎn)生隧道效應(yīng)而有電子逸出，形成隧道電流。電流強(qiáng)度和針尖與樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，當(dāng)探針沿物質(zhì)表面按給定高度掃描時(shí)，因樣品表面原子凹凸不平，使探針與物質(zhì)表面間的距離不斷發(fā)生改變，從而引起電流不斷發(fā)生改變。將電流的這種改變圖像化即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。掃描隧道顯微鏡的分辨率很高，橫向?yàn)?.1～0.2nm，縱向可達(dá)0.001nm。它的優(yōu)點(diǎn)是三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察，而普通電鏡只能觀察制作好的固體標(biāo)本。
利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等分子的原子布陣，和某些生物結(jié)構(gòu)，如生物膜、細(xì)胞壁等的原子排列。
三、顯微操作技術(shù)
圖2-20 尼康NT-88NE顯微操作/注射儀
顯微操作技術(shù)（micromanipulation technique）是指在高倍復(fù)式顯微鏡下，利用顯微操作器（micromanipulator，圖2-20）進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng)的機(jī)械裝置。
顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等。細(xì)胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，Gordon等人（1962）對(duì)非洲爪蟾進(jìn)行核移植獲得成功。我國**學(xué)者童第周等在魚類細(xì)胞核移植方面進(jìn)行了許多工作，并取得了豐碩成果。