熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）
2020-09-04 09:40:49
活細(xì)胞研究遇到的問(wèn)題：
蛋白質(zhì)或其他分子在活細(xì)胞內(nèi)互相結(jié)合的時(shí)間和地點(diǎn)是了解它們功能的關(guān)鍵問(wèn)題。要回答這一問(wèn)題，需將蛋白質(zhì)標(biāo)上不同的熒光團(tuán)。但是，光學(xué)顯微鏡的分辨率將蛋白質(zhì)檢測(cè)精度限制在大約0.2μm左右。要研究蛋白質(zhì)成分的相互物理作用，需要高的分辨率。
二、什么是FRET？
FRET就是采用非放射方法，在供體和受體相互靠得很近（1-10 nm）時(shí)，將光子能從一個(gè)受激發(fā)的熒光團(tuán)（供體）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)熒光團(tuán)（受體）。采用FRET，可以解決*過(guò)光學(xué)顯微鏡分辨率限制的分子相對(duì)鄰近度問(wèn)題，來(lái)顯示（例如）（1）二個(gè)蛋白質(zhì)成分間分子相互作用；（2）一個(gè)分子內(nèi)部（如酶活動(dòng)能力、DNA/RNA形態(tài)）的結(jié)構(gòu)變化；（3）采用象CFP-YFP Cameleon這樣特別的FRET-工具的離子濃度
CFP受光激發(fā)后便發(fā)射光
CFP離YFP的距離大于10nm
YFP沒(méi)有受到激發(fā)，因此也不發(fā)射光
CFP離YFP的距離大于10nm
YFP沒(méi)有受到激發(fā)，因此也不發(fā)射光
CFP受光激發(fā)后但沒(méi)有發(fā)射小光。
CFP與YFP非常接近（1-10 nm）
CFP沒(méi)有受光激發(fā)，但發(fā)射光
CFP與YFP非常接近（1-10 nm）
CFP沒(méi)有受光激發(fā)，但發(fā)射光
三、FRET原理
受激發(fā)后的熒光團(tuán)（供體）將受激發(fā)的靜能轉(zhuǎn)移到一個(gè)光吸收分子（受體）。這種能的轉(zhuǎn)移是非放射性的，其主要原因是供體和受體之間的偶極-偶極間的相互作用。通過(guò)雙偶極反應(yīng)，一個(gè)處于激發(fā)態(tài)的供體以非激發(fā)方式將能量傳遞給旁邊的受體。這一理論基于將被激發(fā)熒光分子看成振蕩偶極子，能夠和有同一震蕩頻率的另一個(gè)偶極子發(fā)生能量交換。
只有幾個(gè)熒光團(tuán)對(duì)才適合FRET實(shí)驗(yàn)，因?yàn)?，除了其他必要條件（如偶極子定向、足夠的熒光壽命），供體放射光譜必須將受體的激發(fā)光譜重疊起來(lái)。已知的FRET對(duì)是CFP/YFP、BFP/GFP、GFP/諾丹明、FITC/Cy3
CFP/YFP FRET能量圖:
CFP（供體）受到激發(fā)，但是大多數(shù)能量不會(huì)引起青綠色放射體；而是被傳送到YFP（受體）；因此，所產(chǎn)生的放射體主要是黃色的。
四、FRET的應(yīng)用
象綠色熒光蛋白質(zhì)（GFP）這樣的熒光蛋白質(zhì)（FPs）對(duì)FRET實(shí)驗(yàn)非常有吸引力。它們可以以基因方法被融合到有關(guān)蛋白質(zhì)中去并且用細(xì)胞表達(dá)，使它們成為基因表達(dá)和蛋白質(zhì)在活細(xì)胞中本地化的極好報(bào)告系統(tǒng)?？梢蕴峁┎煌庾V特性的增強(qiáng)型FP變異。
用青綠色的CFP作供體、黃色的YFP作受體是*適合做活細(xì)胞FRET實(shí)驗(yàn)的，因?yàn)?/span>CFP放射光譜部分重疊了YFP激發(fā)光譜。
當(dāng)它們足夠接近時(shí)，用CFP的吸收波長(zhǎng)激發(fā)，CFP的發(fā)色基團(tuán)將會(huì)把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比，對(duì)空間位置的改變非常靈敏[1-2 ]。例如要研究?jī)煞N蛋白質(zhì)a和b間的相互作用，可以根據(jù)FRET原理構(gòu)建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白質(zhì)b、 YFP(yellow fluorescent protein)。用CFP吸收波長(zhǎng)433nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)靈巧設(shè)計(jì)，使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b沒(méi)有發(fā)生相互作用時(shí)，CFP與YFP相距很遠(yuǎn)不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測(cè)到的是CFP的發(fā)射波長(zhǎng)為476nm的熒光；但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與b發(fā)生相互作用時(shí)，由于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使CFP與YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時(shí)檢測(cè)到的就是YFP的發(fā)射波長(zhǎng)為527nm的熒光(圖1)。將編碼這種融合蛋白的基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用。