常用于免疫熒光組織化學染色的熒光素
2020-09-04 09:41:58
常用于免疫熒光組織化學染色的熒光素有：異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基羅丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克薩斯紅(Texas red)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、花青類(cyanine，如Cy3、Cy5)等。此外還有一些新型熒光染料，如量子點。
(1)異硫氰酸熒光素(FITC)：FITC性質穩(wěn)定，易溶于水和乙醇，能與蛋白質結合，是檢測組織細胞內蛋白質*常用的熒光探針。它還能標記抗體，可用于免疫組織化學單染或多重染色。缺點是在光照下易淬滅，易受自發(fā)熒光影響。*大激發(fā)光波長為490nm；*大發(fā)射光波長為525nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光。
(2)四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)：該熒光素能與細胞內蛋白質結合，比FITC穩(wěn)定性好，在生理條件下對pH值變化不敏感，熒光強度受自發(fā)熒光干擾小。*大激發(fā)光波長為550nm；*大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)出的黃綠色熒光對比鮮明，常用于免疫熒光組織化學雙重染色。
(3)四乙基羅丹明(RB200)：能與細胞內蛋白質結合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性質穩(wěn)定，可長期保存，廣泛應用于雙標記示蹤染色。*大激發(fā)光波長為570nm，*大發(fā)射光波長為595-600nm，呈橙紅色熒光。
(4)花青類染料：常用的有Cy3、Cy5等，能與細胞內蛋白質結合。這類染料的熒光特性與傳統(tǒng)熒光素類似，但水溶性和對光穩(wěn)定性較強，熒光量子產(chǎn)率較高，對pH等環(huán)境不敏感。常用于多重染色。Cy3*大激發(fā)光波長為570nm，*大發(fā)射光波長為650nm，呈綠色熒光。但是，在綠光光譜波長激發(fā)下，Cy3也可出現(xiàn)紅色熒光。Cy5的*大激發(fā)光波長為649nm，*大發(fā)射光波長為680nm，呈紅色熒光。由于Cy5的*大發(fā)射波長為680nm，很難用裸眼觀察，而且不能使用高壓汞燈作為理想的激發(fā)光源，因此，使用普通熒光顯微鏡時，不推薦使用Cy5。通常觀察Cy5時需使用激光掃描共聚焦顯微鏡。
(5)乙酸甲酯：其本身不發(fā)熒光，但透膜進入細胞質后，在酯酶的作用下轉變?yōu)榫哂袩晒馓匦缘囊宜峒柞?。其激發(fā)光譜有pH依賴性，是使用*多的細胞內pH熒光指示劑。*大激發(fā)光波長為505nm，*大發(fā)射光波長為530nm，呈綠色熒光。
(6)Indo-1：是典型的雙發(fā)射熒光探針。無鈣時在485nm左右有發(fā)射峰，結合鈣后，則在405nm處有發(fā)射峰，兩者的比值與細胞內游離鈣離子濃度成線性關系，將此比值與標準曲線相比即可得出細胞內游離鈣濃度，因此，可利用此探針定量檢測細胞內游離鈣離子濃度。*大激發(fā)光波長為330/346nm，*大發(fā)射光波長為405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)熒光。
(7)量子點(quantum dot)：是近年來研制的一種新型熒光染料，又稱半導體納米晶體(semiconductor nanocrystal)，是由幾百或幾千個納米級顆粒構成的半導體材料，性質穩(wěn)定，溶于水，細胞本身不能合成和組裝。量子點具有熒光時間長、產(chǎn)生多種顏色、檢測方便和應用范圍廣等優(yōu)點。當某一波長的激發(fā)光對多種大小不同的量子點進行照射時，可以同時觀察到多種顏色，因而可同時進行多個目標的觀察和檢測。量子點可與抗體、鏈霉親和素等多種分子進行耦聯(lián)，檢測靶分子的分布和功能。