怎么才能選對(duì)你的共聚焦顯微鏡？
共聚焦顯微鏡比寬場(chǎng)顯微鏡具有更多的優(yōu)勢(shì)，共聚焦顯微鏡可以對(duì)樣品做連續(xù)光學(xué)切片并排除非焦平面的信號(hào)干擾，為此共聚焦顯微鏡的應(yīng)用也的確更為普遍。不過(guò)市面上各種各樣的共聚焦顯微鏡越來(lái)越多，要如何進(jìn)行選擇呢？
共聚焦顯微鏡比寬場(chǎng)顯微鏡具有更多的優(yōu)勢(shì)，共聚焦顯微鏡可以對(duì)樣品做連續(xù)光學(xué)切片并排除非焦平面的信號(hào)干擾，為此共聚焦顯微鏡的應(yīng)用也的確更為普遍。不過(guò)市面上各種各樣的共聚焦顯微鏡越來(lái)越多，要如何進(jìn)行選擇呢？在選擇共聚焦顯微鏡時(shí)，*基本也*重要的考慮因素主要有兩點(diǎn)：您想要研究的樣本類(lèi)型（如：固定的細(xì)胞還是活細(xì)胞），以及您想要進(jìn)行的檢測(cè)類(lèi)型（如：靜態(tài)還是動(dòng)態(tài)細(xì)胞過(guò)程）。
固定細(xì)胞的共聚焦成像
要對(duì)固定且染色了的細(xì)胞或組織成像，我們一般選擇激光掃描共聚焦（LSCM）。這主要是因?yàn)楣潭ǖ乃兰?xì)胞缺乏活細(xì)胞中的快速生物學(xué)事件，能更好的受益于LSCM較高的空間分辨率。LSCM成像是通過(guò)激光對(duì)樣品進(jìn)行光學(xué)層切，掃描速度（取決于掃描陣鏡速度）一般為1fps。曝光時(shí)間越長(zhǎng)意味著光漂白的風(fēng)險(xiǎn)越大，但對(duì)于固定的死細(xì)胞，時(shí)間并不是很關(guān)鍵，我們可以通過(guò)拍多張圖片來(lái)平均。
活細(xì)胞的共聚焦成像
成像活細(xì)胞需要額外的保護(hù)，以免不友好環(huán)境的干擾。在成像時(shí)，我們首先需要考慮的是保持細(xì)胞的活性和健康，恒溫加熱元件和灌流系統(tǒng)是必不可少的，尤其對(duì)于進(jìn)行time-lapse（時(shí)間序列）的研究來(lái)說(shuō)。控制活細(xì)胞生理狀態(tài)的快速生化事件是大多數(shù)人*想要研究的，但這些事件對(duì)于傳統(tǒng)LSCM來(lái)說(shuō)太快了。此外，LSCM的長(zhǎng)時(shí)間曝光還會(huì)引發(fā)毒性光照損傷細(xì)胞。因此，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像會(huì)需要特殊的共聚焦顯微鏡。
對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行共聚焦成像一般有兩個(gè)選擇：快速掃描的激光掃描共聚焦和轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦。快速掃描共聚焦顯微鏡用較快的共振掃描陣鏡（resonant scanning mirrors）取代較慢的galvanometers mirrors，能使掃描速度達(dá)到30fps；而轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦(SDCMs)的優(yōu)勢(shì)在于掃描速度更快（雖然不可避免的要損失空間分辨率），其速度理論上可達(dá)到2000fps（實(shí)際上往往受到其他因素的限制）。
如果您擔(dān)心光漂白或者很弱的熒光信號(hào)，那么SDCM可能更加適合。SDCM采用兩個(gè)帶有陣列微孔的轉(zhuǎn)盤(pán)轉(zhuǎn)動(dòng)來(lái)分散激發(fā)光，不同于LSCM對(duì)樣品進(jìn)行點(diǎn)掃描，SDCM一次采集多個(gè)點(diǎn)（大約100個(gè)像素點(diǎn)），因而速度大大增加，并且SDCM的光漂白及光毒性更小。不過(guò)，您也可以采用快速掃描共聚焦來(lái)提高掃描速度，配合高靈敏檢測(cè)器，降低激發(fā)光能量來(lái)減少光毒性，這樣能夠保證傳統(tǒng)共聚焦的豐富功能。
自動(dòng)化共聚焦成像系統(tǒng)
一些研究者喜歡想方設(shè)法對(duì)顯微鏡進(jìn)行改造，以適應(yīng)自己的個(gè)性化需求。而有些研究者則對(duì)顯微鏡到底是如何工作的根本不敢興趣。對(duì)于后者而言，一臺(tái)自動(dòng)化的共聚焦顯微鏡可能更合他們胃口。舉例來(lái)說(shuō)，Olympus FluoView FV10i就是這樣一臺(tái)全自動(dòng)桌面型4激光共聚焦顯微鏡，其緊湊的整合結(jié)構(gòu)對(duì)安裝空間基本沒(méi)有要求。這類(lèi)儀器非常適合那些需要每天做很多圖像數(shù)據(jù)采集的研究者，當(dāng)然它們并不能完全體現(xiàn)傳統(tǒng)共聚焦的功能及靈活擴(kuò)展性。此外，Nikon A1也是一套全自動(dòng)共聚焦系統(tǒng)。與大多數(shù)傳統(tǒng)共聚焦掃描顯微鏡一樣，Nikon A1采用galvanometer掃描頭，其分辨率比采用混合式掃描頭的A1R高，但速度稍遜（A1R約30fps）。
增加對(duì)各種共聚焦顯微鏡類(lèi)型的了解，可以幫您找到*適用的儀器。如今，即使不考慮全自動(dòng)系統(tǒng)，不論您選擇什么機(jī)型，大多數(shù)系統(tǒng)都內(nèi)置有豐富的人性化功能，可以使您收益匪淺。
原文提到的掃描速度并沒(méi)有標(biāo)注對(duì)應(yīng)的掃描分辨率，僅供參考，具體數(shù)據(jù)請(qǐng)查閱相應(yīng)產(chǎn)品資料。
現(xiàn)在，共聚焦顯微鏡正不斷向更快速、更靈敏、更高分辨率及更好的可擴(kuò)展性發(fā)展，不斷有新技術(shù)誕生。速度方面，有共振快速掃描頭及轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦；靈敏度方面有AOBS分光系統(tǒng)及更靈敏的檢測(cè)器（HyD，GaAsp PMT）；分辨率方面有*高分辨率（SIM，STED， PALM，STORM）；此外還有多光子、白激光、SMD等技術(shù)。我們?cè)谶x擇共聚焦系統(tǒng)時(shí)*好能多聽(tīng)聽(tīng)各廠家的介紹，以便對(duì)這些技術(shù)有所了解，根據(jù)自己可能進(jìn)行的研究選擇*合適的儀器。