奧林巴斯顯微鏡的對比度

奧林巴斯顯微鏡的對比度

當(dāng)成像標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下，在強(qiáng)度和/或顏色的差別創(chuàng)建圖像的對比度，它允許單獨(dú)的特征和試樣的細(xì)節(jié)變得可見。 對比度被定義為在圖像和鄰近的背景相對于整個背景強(qiáng)度之間的光強(qiáng)度之差。 在一般情況下，0.02（2％）的最低對比度值是需要由人眼分辨的圖像和它的背景之間的區(qū)別。 對于其他檢測器，如電影，視頻攝像機(jī)，或光檢測器（CCD和CMOS器件），最小對比度往往是不同的值。 與每個檢測器中，信噪比（噪聲是所有的光學(xué)系統(tǒng)缺乏圖像信息的光的）必須足夠大，以連貫圖像的形成方面來解釋。

通過光，亮度，反射率，雙折射，光散射，衍射，熒光或顏色變化的吸收，在檢體產(chǎn)生的對比度已經(jīng)在明場顯微鏡成像樣品的典型裝置。 細(xì)節(jié)的脫穎而出映襯或其他鄰近的細(xì)節(jié)的能力是標(biāo)本對比度的量度。 在一個簡單的公式計算，對比度可以被描述為：

其中I(b)是背景的強(qiáng)度，I(s)是檢體的強(qiáng)度。 從這個等式中，顯而易見的是，樣品的對比度是指圖像中的最高和最低強(qiáng)度之間的關(guān)系。 在圖1中所示的曲線示出背景亮度對對比度的影響。 當(dāng)背景是很暗灰色顏色（I(b)等于0.01），在圖像強(qiáng)度的小變化會產(chǎn)生大的變化的對比。 通過減輕的背景有點(diǎn)淺灰色（I(b)等于0.10），在圖像亮度的微小變化提供對比一個有用的范圍。 在仍然較亮的背景顏色（I(b)>0.20），圖像的對比度是相對不敏感的背景強(qiáng)度和大的變化I(b)只產(chǎn)生小的增加或減少中的圖像對比度。

雖然在現(xiàn)代顯微鏡發(fā)現(xiàn)該光學(xué)系統(tǒng)可以是能夠以高倍率制造高清晰度的圖像的，這種能力是毫無價值沒有足夠的對比度的圖像中。 反差不是標(biāo)本的固有特性，但是依賴于試樣的光并耦合到其可靠地記錄該圖象信息用的檢測器的能力的光學(xué)系統(tǒng)的效率的相互作用。 在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的圖像對比度的控制，取決于幾個因素，孔徑光闌的主要設(shè)置，像差的光學(xué)系統(tǒng)中的程度，所使用的光學(xué)系統(tǒng)的對比度，檢體的種類，和光學(xué)檢測器。 有幾個網(wǎng)站，在顯微鏡下，允許調(diào)整對比度。 這些包括字段光圈，聚光光圈，額外放大倍數(shù)為視頻檢測器，電子照相機(jī)伽瑪，膠片伽瑪，印刷紙伽瑪，圖像處理的實(shí)時，以及檢體染色。

因?yàn)槿搜鄹兄粋€目的是通過在其圖像中產(chǎn)生的對比度，可以很容易地引入歧途除非有發(fā)生，以產(chǎn)生所述圖像中的對比度的光的事件的知識。 圖2示出了包含根據(jù)不同的對比度模式成像用光學(xué)顯微鏡透明，無色人類頰細(xì)胞相同的視場的3顯微照片：明場，相差和霍夫曼調(diào)制對比。 這是很明顯的是，三個圖像出現(xiàn)不同，并且由于這些變化，一個顯微鏡可能在從各視場不同的結(jié)論。 在圖2（a）中示出的細(xì)胞進(jìn)行成像用顯微鏡在明場模式下操作與聚光鏡光圈關(guān)停足以使試樣邊緣可見。

使用相差光學(xué)面頰細(xì)胞相同的視場示于圖2（b）。 注意暗區(qū)域內(nèi)和周圍的物體的邊緣明亮外區(qū)域，如細(xì)胞膜和細(xì)胞核（稱為光暈，并且是偽影）。 在此視圖中，很難以指定的細(xì)胞的邊緣和解釋的圖像中的暗區(qū)和亮區(qū)的原因。 該細(xì)胞也顯得比較平淡。 最后，在圖2（c）所示的單元使用霍夫曼調(diào)制對比，其中圖像的一側(cè)是暗，而其相對側(cè)是明亮的，導(dǎo)致偽三維物體的感知進(jìn)行成像。 在圖2中的每個視場提供了不同的試樣的圖像，并導(dǎo)致不同的解釋，這只能通過了解如何在顯微鏡中創(chuàng)建這些圖像被破譯。

對于許多標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡，尤其是未染色或生活材料，對比是如此的差，試樣基本保持隱形不顧物鏡的解決或明確分開細(xì)節(jié)的能力。 通常情況下，為這樣的標(biāo)本，而不是通過殺死或用化學(xué)染料或固定劑，以改變它們是重要的。 這必然導(dǎo)致顯微鏡進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對比度增強(qiáng)技術(shù)對超過一百年，以試圖提高檢體的能見度和帶來更詳細(xì)的圖像，而不改變試樣本身。 它是一種常見的做法，以減少低于推薦大小聚光鏡光圈或降低臺下聚光鏡增加標(biāo)本的對比。 不幸的是，雖然這些演習(xí)確實(shí)會增加對比度，他們也嚴(yán)重降低分辨率和清晰度。

奧林巴斯顯微鏡要考慮的是如何光和物質(zhì)討論控制在光學(xué)顯微鏡下的對比度的方法之前，進(jìn)行交互的特性是有用的。 負(fù)責(zé)照亮試樣的光可以是空間相干的，非相干或部分相干的。 例如，光束可以成形在狹縫或環(huán)形的形式，和選定波長垂直于傳播方向或在由于偏振單一方向振動在所有方向上可組成。

一些樣品被認(rèn)為振幅對象 ，因?yàn)樗鼈兾展獠糠值鼗蛲耆?，并且因此可以使用傳統(tǒng)的明場顯微術(shù)可以容易地觀察到。 別人認(rèn)為是自然色的或人工染色化學(xué)染料的顏色也可以清晰地成像的顯微鏡。 這些污漬或自然的色彩吸收白光穿過的某些部分和透射或反射其他顏色。 通常情況下，污漬相結(jié)合，產(chǎn)生對比的顏色，如藍(lán)色蘇木染色的細(xì)胞核結(jié)合粉色曙紅的細(xì)胞質(zhì)中。 它是利用污漬標(biāo)本不容易吸收光線，從而使這些圖像肉眼可見的普遍做法。

其它試樣不吸收光并且被稱為相位對象 。 因?yàn)槿说难劬χ荒軝z測強(qiáng)度和顏色的差異，由于對象的相位變化必須被轉(zhuǎn)換成強(qiáng)度的差異。 相位標(biāo)本的特征在于由若干標(biāo)準(zhǔn)，包括它們的形狀（通常為圓形或平的），內(nèi)部光散射元件，厚度的密度，以及獨(dú)特的化學(xué)或電的結(jié)構(gòu)特性（共同分組為折射率）。 厚的樣品可以是比較明確的，并且僅包含幾個光散射元件，或者它們可以包含許多散射元件沒有通過光，使檢體有效地不透明的透射照明。 這些標(biāo)本通常被稱為反射光的標(biāo)本。

當(dāng)考慮光的方法，以提高檢體的對比度，考慮能夠被操縱以創(chuàng)建的那些特征的強(qiáng)度變化，使它們可見的試樣的各種特性是有用的。 一個主要的問題是該對象的特征下了一套獨(dú)特的情況下，將被改造成一個不同的強(qiáng)度。

樣品的細(xì)節(jié)和邊緣具有一個大小接近的成像光的波長將衍射或散射光，只要是在試樣和其周圍介質(zhì)（環(huán)繞）之間的折射率的差。 折射率被定義為速度的比值通過空氣或真空通過對象除以光速的點(diǎn)亮。 因?yàn)楣馔ㄟ^的任何材料的速度小于光在真空中的速度，折射率總是超過1.0標(biāo)本檢查用顯微鏡的值。 為了解決物體之間的小的距離，并以再現(xiàn)它們的形狀與合理的保真度，衍射光的大角度必須由顯微鏡物鏡捕獲。

由物鏡聚集衍射（或偏離）光必須進(jìn)入一個銳聚焦在圖像平面中，以產(chǎn)生樣品的細(xì)節(jié)，如示于圖3.在該圖像平面上，光波包括衍射光發(fā)生干涉以衍射光。 光的干擾之后的能見度非常依賴于光照射樣品的一致性，與能見度通過增加一致性比例增加。 在光學(xué)顯微鏡下，聚光鏡孔徑光闌開口尺寸控制的光撞擊在試樣上的空間相干性。 減小光闌開口尺寸產(chǎn)生更大的空間相干性。（奧林巴斯顯微鏡）

顯微鏡長期以來依靠降低聚光鏡光圈開口尺寸增加階段標(biāo)本顆粒和邊緣的知名度。 對比度為振幅對象也可以由聚光光圈的適當(dāng)?shù)恼{(diào)整提高。 不管它們是否屬于一個幅度或相位標(biāo)本的小物件，邊和顆粒將衍射光。 僅此衍射光的一部分被由物鏡（見圖3）由于物鏡的數(shù)值孔徑限制捕獲。 未收集剩余的衍射光表示丟失的圖像信息。 正確設(shè)置聚光鏡光圈開口尺寸為增強(qiáng)標(biāo)本圖像對比度和引進(jìn)衍射文物之間的權(quán)衡。 這些表現(xiàn)在分辨率，衍射環(huán)的疊加，以及其他不期望的光學(xué)效應(yīng)從區(qū)域中不在共同焦點(diǎn)試樣始發(fā)的損失。 作為衍射極限被接近，圖像的對比度變低為目的的信息變得越來越小，空間頻率變大。

井上和彈簧所描述的圖像對比度的比值標(biāo)本對比度和在由實(shí)際和理想正弦圖像時作為空間頻率的函數(shù)作圖的光學(xué)傳遞函數(shù)（OTF）占據(jù)的位置的相移。 的情況下的光的來自試樣的分布變得正弦，光學(xué)傳遞函數(shù)的模量變得調(diào)制傳遞函數(shù)（MTF）。 作為空間頻率的增加，調(diào)制傳遞函數(shù)減小和標(biāo)本的對比度降低。

對于每一個物鏡，具體的調(diào)制傳遞函數(shù)是依賴于物鏡的設(shè)計和數(shù)值孔徑，對比度生成，照射光的波長的模式，和臺下聚光鏡的數(shù)值孔徑。 物鏡后側(cè)焦點(diǎn)面的邊緣作為一個低通濾波器，用于衍射光，它必須被聚焦在圖像平面為干擾發(fā)生并形成顆粒或邊緣的圖像。 聚焦顯微鏡帶來這些衍射光波一起在中間像平面。 的光的波前相對于所述檢體的角度決定的難度在側(cè)重于光滑圓形表面，其通常含有無衍射部位的頂部或底部的程度。然而，球形標(biāo)本或纖維的邊緣容易集中，因?yàn)檫吘壗涌谑窃谧銐虻慕窍虿ㄇ昂脱苌涞墓狻?/span>

當(dāng)討論相位標(biāo)本，我們將定義一個對象作為檢體的任何解析部。 如示于圖4。在該圖中的許多對象將是平的或板狀，該對象具有一厚度（t）和折射率，N（S）。 周圍介質(zhì)的折射率為n(m)。

光行進(jìn)通過與光路的檢體，OP = t(n(s))，并通過與光路周圍的媒體，OP = t(n(m))。 光程差（OPD）可以表示為：

與相位差之中：

其中π是一個常數(shù)（3.14159265），λ是光照射在試樣的波長。 的光程差是兩個方面的產(chǎn)品：厚度（t）和在折射率（n）之差。 所述OPD常常可以相當(dāng)大，即使對象物的厚度是相當(dāng)薄的。 另一方面，當(dāng)檢體和周圍介質(zhì)的折射率是相等的，所述OPD是零，即使試樣的厚度是非常大的。 在這種情況下，光通過對象行進(jìn)僅僅延遲（相位差），相對于通過所述環(huán)繞的相等厚度的光。 相位差都不能檢測由人的眼睛。

在相差顯微鏡被設(shè)計為采取的檢體，并在周圍的培養(yǎng)基中的對象之間的相位差的優(yōu)勢。 然而，它不是簡單的相位差是必要的，但也從試樣的衍射必須發(fā)生在相差顯微鏡工作。

相位物體的最常見的形狀是連續(xù)變化的光路或密度，如示于圖5。在此情況下的半球形標(biāo)本1，相位物體的側(cè)面可以用數(shù)學(xué)近似通過棱鏡的形狀，如下面所討論。 相位物體的圖5中的折射率為n(s)和該周圍介質(zhì)中，n(m)。 在形狀自由基幾何轉(zhuǎn)變?yōu)橄辔晃矬w只發(fā)生在邊緣A和B（見圖5的（a））。 入射光撞擊物體垂直于平面AB，而平面波陣面是平行于AB。

在1的邊界（圖5中的圓形相位物體的頂點(diǎn)（a））的基本上平行于入射的波前，而在邊界A和 B是垂直的。區(qū)2到4是由一個相切的相位對象（圖5（b））的圓形表面所限定的微型棱鏡。 在“棱鏡”角度較小，在區(qū)域2比在區(qū)域4，它是相對的區(qū)域4'。 在邊緣A和 B的衍射是最強(qiáng)的。

因而，彎曲的對象是由許多棱鏡和對象的相對側(cè)都定向在相反方向的棱鏡。 最陡的棱鏡是在球形物體的赤道，而棱鏡用最少的斜率分別位于頂部和底部。 這些微型棱鏡形成光學(xué)梯度：

其中α是切線相對于所述平面波前 的角度。 注意，光學(xué)梯度是兩個方面的產(chǎn)品：該光通過邊之間的角度（α），并且在折射率的差（n(s) - n(m)）。 光穿過棱鏡由角Φ（見圖5（c）和圖5（d））的變化方向。 在方向上的變化可能是大的，即使在斜坡或邊界梯度可以是小的，如果在折射率的差較大。 如果折射率是相同的，所述光波通過無折射的相位物體通過。 光射出的棱鏡的方向是依賴于相位物體(n(s))和其周圍介質(zhì)之間的折射率的相對差（n(m);參見圖5（c）和圖5（d））。

正如我們前面所討論的，圓形的相位物體連續(xù)變化的光學(xué)梯度，并且每個單獨(dú)的光學(xué)梯度“棱鏡”創(chuàng)建的光偏轉(zhuǎn)的角度不同。 圖5（c）示出了偏轉(zhuǎn)的方向，當(dāng)周圍介質(zhì)的折射率比相位物體更大（n(m) > n(s)），和圖5（d）示出的方向時，情況正好相反（n(m) < n(s)）。 偏轉(zhuǎn)，Φ，所述的角度是成正比的切線角度（α）和折射率差(n(s) - n(m)），使得：

對于小角度：

總結(jié)光學(xué)梯度的邊界，其中的“棱鏡”的效果時，相位物體的折射率大于周圍介質(zhì)的是，該對象的每個斜坡上大小相等的梯度偏轉(zhuǎn)以相同的角度。 此偏轉(zhuǎn)角依賴于相對折射率差和幾何切線角度（α）。 當(dāng)介質(zhì)（n(m)）的折射率大于所述對象（n(s)）的折射率，偏轉(zhuǎn)距離時，情況正好相反的對面。 當(dāng)沒有梯度，有燈的無偏轉(zhuǎn)穿過。

光可以與樣品通過各種機(jī)制進(jìn)行交互以產(chǎn)生圖像對比度。 這些包括反射從表面，吸收，折射，偏振，熒光和衍射。 相反，也可以通過照相或數(shù)字電子技術(shù)增加了在顯微鏡的光學(xué)元件和照明模式的物理改性以及操縱最終圖像。 下面的討論突出了檢體和光之間的各種相互作用和回顧一些已開發(fā)，以提高檢體的對比光學(xué)顯微技術(shù)。

當(dāng)入射的光線照射不透明表面，它被反射的方式，是專用于該表面的地形。 非常光滑的表面反射的光以一定的角度等于該入射光，被稱為鏡面反射一個機(jī)制。 不平或漫反射表面往往反映光在所有可能的角度由這種現(xiàn)象被稱為漫反射 ，導(dǎo)致光進(jìn)入物鏡的量減少。 對比度在反射光顯微術(shù)可通過仔細(xì)試樣制備得到增強(qiáng)。 金相樣品往往蝕刻反應(yīng)液體和氣體，以揭示晶粒邊界和/或拋光，以增加光量反射到顯微鏡。 漬，在熒光染料，薄膜，和金屬涂層的形式，也可用于引入在反射光顯微鏡標(biāo)本的對比度。 雙折射標(biāo)本可利用偏振光的反射光，透明的相位對象通常觀察使用諸如反射微分干涉對比，暗場照明，和霍夫曼調(diào)制對比技術(shù)受試者進(jìn)行成像。

人眼對在檢體的振幅和波長的差異非常敏感。 出于這個原因，許多標(biāo)本切成非常薄的切片（范圍從1-30微米厚），并用化學(xué)染料，以增加對比度和居住標(biāo)本內(nèi)的結(jié)構(gòu)之間進(jìn)行區(qū)分。 這種技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)普遍用于生物標(biāo)本數(shù)百年。 染料選擇性地從一個或幾個波長吸收光線，并通過或反射所有其他波長的光。 一個例子是藍(lán)色染料，吸收所有可見光波長除藍(lán)色，這是從反射并通過檢體發(fā)送。 的生物試樣的內(nèi)部結(jié)構(gòu)元件通常染色與染料以選擇性染色這些元素的混合物，增加對材料的背景下，或者是透明的或染色的不同的顏色的對比。

這些技術(shù)也適用于熒光染料，其可用于增加標(biāo)本對比度具有特異性的程度高。 當(dāng)熒光試樣刺激的可見光或近紫外光一個波長，它們經(jīng)常發(fā)光的波長較長，從而成為可見或?qū)Ρ认鄬υ诂F(xiàn)場或背景（圖6）的其他對象。 技術(shù)中的熒光顯微鏡進(jìn)行了詳細(xì)的顯微鏡底漆的另一部分進(jìn)行討論。

染色標(biāo)本的對比度增加的早期和目前使用的方法是利用色彩對比濾光片，雷登涂漆明膠平方（自Kodak），或干涉濾光器中的光路。 例如，如果檢體染色用紅色污點(diǎn)，綠色過濾器會變暗紅色區(qū)域從而增加對比度。 另一方面，綠色過濾器將減輕任何綠色染區(qū)。 彩色濾光片是非常有價值的輔助工具標(biāo)本的對比，尤其是當(dāng)黑白顯微攝影是物鏡。 綠色過濾器用于消色差物鏡，這是球的綠燈糾正，并相差物鏡，這是專為操作波長假設(shè)使用綠色光的利用尤其重要，因?yàn)橄鄻?biāo)本通常是透明的，缺乏內(nèi)在的顏色。

各向異性材料通常表現(xiàn)出兩個或更多的折射率，并因此被稱為雙折射，或雙重折射。 其中包括在這一類中的樣品是礦物質(zhì)，晶體（其表現(xiàn)出的結(jié)構(gòu)對稱性的高度），纖維，毛發(fā)，和其它生物標(biāo)本。 當(dāng)光進(jìn)入一個非光學(xué)（軸比光軸除外）的各向異性晶體的軸，它被折射成兩個射線每個極化與取向成直角彼此其振動方向，并以不同的速度行進(jìn)。 所得的光波被極化，并且可以干擾時，在顯微鏡分析器重新組合以產(chǎn)生被高度著色并含顯著量的對比雙折射標(biāo)本的圖像。

活標(biāo)本和其他階段的對象，這往往產(chǎn)生于明照明觀察較差的圖像，是由光下相差，霍夫曼調(diào)制對比度和微分干涉對比照明觀察，而不是化學(xué)意味著清晰可見。 這些技術(shù)需要在顯微鏡特殊的光學(xué)元件，但通常會產(chǎn)生足夠的對比度的圖像，以顯示有關(guān)標(biāo)本結(jié)構(gòu)的重要細(xì)節(jié)。 這些對比度增強(qiáng)技術(shù)的更深入的討論可以在我們可以找到專門的顯微技術(shù)部分。

另一種簡單的技術(shù)用于對比度改進(jìn)涉及一安裝介質(zhì)具有折射率從該檢體的顯著不同的選擇。 例如，硅藻可安裝在各種對比增強(qiáng)介質(zhì)，諸如空氣或商用介質(zhì)蘇合香的。 在折射率差提高了這些無色物體的對比度，并呈現(xiàn)他們的輪廓和標(biāo)記更為明顯。 以下部分描述了許多用于當(dāng)今的顯微鏡，以提高標(biāo)本的對比更復(fù)雜的技術(shù)。

表1列出所選擇的對比度增強(qiáng)技術(shù)（S），適用于各種標(biāo)本和材料進(jìn)行了研究與兩個發(fā)射和反射光顯微鏡的摘要。 該表可被用作粗略的指導(dǎo)，以接近在光學(xué)顯微鏡特定成像問題。