奧林巴斯顯微鏡測試目標強度掃描

奧林巴斯顯微鏡測試目標強度掃描

在光學(xué)顯微鏡的光學(xué)性能通常通過其響應(yīng)成像被用來測量對比度傳遞函數(shù)的高對比度周期線光柵時確定的。一個理想的測試目標（MBL-NNF）為此在海洋生物實驗室在伍茲霍爾，馬薩諸塞州與國家納米制造設(shè)施在康奈爾大學(xué)合作開發(fā)的。

除了周期性的線間距，所述MBL-NNF測試目標提供單和配對線和點和一個測試西門子星（圖1），它允許一個仔細分析由這些微觀特征產(chǎn)生的一個函數(shù)的衍射圖案的兩個照明模式。

互動教程演示，從目前的一個平場復(fù)消色差物鏡測MBL-NNF測試目標的定期線圖案使強度掃描。 光柵分別以515納米的激光波長和0.82的聚光鏡的數(shù)值孔徑成像的由在非共焦的傳送模式的掃描激光顯微鏡以40倍/ 0.95 NA物鏡。 強度進行平均平行于光柵線條的尺寸。 要查看強度的整個范圍，將滑塊移動到無論是左（較低的空間頻率）或右（高空間頻率）。 需要注意的是強度取決于空間頻率時，作為*大的在低頻和*低處的更高的頻率。

輸出信號的調(diào)制，光波的形成樣品的圖像的強度，對應(yīng)于在顯微鏡圖像對比度的形成。 因此，MTF對于特定的光學(xué)顯微鏡的測定可以由周期線或間隔存在于一個樣品所造成的圖像中的正弦強度而變化作為空間頻率的函數(shù)產(chǎn)生的對比度而獲得。 如果具有1微米（交替吸收和透明線對之間的距離）的空間周期的檢體，使用浸油成像在高數(shù)值孔徑（1.40）與匹配的物鏡/聚光鏡對，各個線對將被清楚地分辨在顯微鏡。 該圖像將不會是一個忠實的再現(xiàn)線對圖案的，而是會具有的深色和淺色條紋間對比度的中等程度。 降低線對之間的距離為0.5微米的空間周期（空間頻率等于每毫米2000線）將進一步降低在*終圖像對比度，但增加了空間周期為2微米（空間頻率等于每毫米500線）將產(chǎn)生的圖像對比度的相應(yīng)增加。

當空間頻率接近每毫米（空間周期等于0.2微米）5000線，采用的500納米照射波長在高數(shù)值孔徑（1.4）達到用光學(xué)顯微鏡的分辨率極限。 在這一點上，對比度將是幾乎檢測不到與圖像會出現(xiàn)灰色的中性色調(diào)。 在真實的標本，對比度在顯微鏡中觀察到的量取決于圖像的大小，亮度和顏色，但人眼不再檢測周期性在相反的水平低于約百分之三到五對緊密間隔的條紋和可能達不到分辨率的0.2微米的限制。

*終，在顯微鏡達到限制空間頻率（截止頻率），這是關(guān)系到物鏡的數(shù)值孔徑（NA）和照明波長（λ）由下式：

這種關(guān)系表示，在空間頻率的事實具有較大的數(shù)值孔徑和更短的波長照射在顯微鏡的分辨率提高的方面。 光學(xué)分辨率的另一個指標， 羅利兩點準則，基于所述點擴散函數(shù)的分布寬度。 兩點是在檢體相鄰分布由光學(xué)系統(tǒng)分成兩個單獨的點擴散函數(shù)。 這些點擴散函數(shù)的分布的寬度決定的各點的接近程度可以彼此并仍然通過奧林巴斯顯微鏡來解決。

當使用相轉(zhuǎn)移函數(shù)相結(jié)合，光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)制傳遞函數(shù)變?yōu)楣鈱W(xué)傳遞函數(shù)，這是點擴展函數(shù)的傅立葉變換。 傅立葉變換的一個基本屬性是一個函數(shù)的分布寬度成反比其傅立葉變換的分布寬度。 考慮截止頻率以上時，點擴展函數(shù)的一階衍射環(huán)的半徑（r）所討論的數(shù)值孔徑之間的關(guān)系（或艾里斑）表示由等式：

很明顯，r和f（c）是成反比彼此所要求的傅立葉理論。 要注意，在光學(xué)顯微鏡不會突然停止解決間距是小于阿貝極限是很重要的。 取而代之的是在具有增加的空間頻率，往往使試樣具有低固有對比度，即使當它們被隔開的距離大于所述顯微鏡的分辨率極限無法解決的圖象對比度的逐步下降。