徠卡顯微鏡通過測量熒光基團分析的離子濃度變化

一個小區(qū)的許多基本功能強烈依賴于離子的精巧，但盡管如此動態(tài)余額（例如鈣，鎂），電壓電位和細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠之間的pH值和周圍的細(xì)胞外空間。 改變這些余額顯著改變細(xì)胞的行為和功能。 因此，在實時細(xì)胞內(nèi)離子，電壓和pH動力學(xué)測量是研究人員在神經(jīng)科學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞生理學(xué)一般巨大的興趣。 在很多情況下，然而，實際的離子濃度，或在一個小區(qū)或蜂窩網(wǎng)絡(luò)的不同位置的相對變化的確切估計難以用常規(guī)的熒光的方法。 其原因是，這些方法沒有考慮的事實，即在一個小區(qū)的不同的部件或在蜂窩網(wǎng)絡(luò)中的細(xì)胞類型之間的細(xì)胞形態(tài)的差異可能影響其質(zhì)量和發(fā)射的光的量的帳戶。 這可能導(dǎo)致大量的誤解當(dāng)離子濃度，電壓或pH值的動態(tài)變化進(jìn)行了研究。 比例的成像技術(shù)，通過觀察熒光團的發(fā)射波長移位或通過比較熒光團組合的發(fā)光強度，而不是單純的測量強度變化繞過這些問題。

離子濃度和pH值或電壓變化的通過測量熒光發(fā)射的變化估計

研究活動越來越注重識別和時空分布如當(dāng)?shù)氐摹盁狳c”中離子濃度，電壓或pH值在單元格或蜂窩網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化。 這樣的“熱點”常常定位于細(xì)胞的專門的部件或在某些細(xì)胞中的蜂窩網(wǎng)絡(luò)中。 此外，相對于試樣中細(xì)胞代謝或結(jié)構(gòu)方面的其余部分，這些區(qū)域通常具有不同的性質(zhì)。 用于研究動態(tài)生理狀態(tài)的常規(guī)熒光在離子結(jié)合，pH值的變化或電壓變化而變化的排放強度（根據(jù)鈣結(jié)合如熒光4增加了排放）。 然而，這些標(biāo)記不考慮到在結(jié)構(gòu)，直徑或標(biāo)記的攝取/表達(dá)的差異可以引起變化的發(fā)射光的那些不與實際的離子濃度，電壓或pH值的相關(guān)性的量。 定量和同等檢測的變化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或不同的細(xì)胞，不敏感的方法來構(gòu)造的直徑和熒光團濃度是必要的。 而相比之下，非比例成像方法，比率成像提供了機會，可重復(fù)地測量*細(xì)胞內(nèi)離子，電壓和pH水平/改變相對于細(xì)胞直徑，熒光團濃度和成像設(shè)置的光學(xué)性質(zhì)。 但是，比例成像取決于激發(fā)波長或檢測波長，強烈的光源，光學(xué)元件和快速的信號檢測的優(yōu)異的變速器的快速變化。 *快濾光輪，UV光優(yōu)化的物鏡，高度敏感的熒光基團和新的CCD相機的*新發(fā)展使得在高空間分辨率實惠定量高速活細(xì)胞成像。

雙波長激發(fā)/檢測是關(guān)鍵，用于測量熒光團的發(fā)射移

徠卡顯微鏡如上所述，在比率量度攝像的發(fā)光轉(zhuǎn)移僅僅強度變化，而不是被成像。為了測量發(fā)射的變化，熒光團或熒光團的組合的強度的變化，必須通過使用兩種不同的激發(fā)波長或者通過檢測在兩個不同的發(fā)射波長或者測量。 在通常使用的鈣成像染料FURA-2的情況下，該染料具有被激發(fā)的光在340nm和380nm處，檢測波長的波長為510納米。 相反的是，鈣成像染料吲-1通常是激發(fā)光在350nm的波長和檢測波長為405納米和485納米。

圖1：使用比例鈣指示劑Fura-2從鈣成像實驗的時間推移的快照。 描繪有后340納米（左）和380納米（中）的激發(fā)和相應(yīng)計算出的比率的圖像（右）假彩色圖像。 所述圖像系列示出了三個個時刻：在時間的*點（1）單元，不刺激，細(xì)胞內(nèi)鈣離子是在靜息水平。 在第二時間點（2）的細(xì)胞受到刺激和鈣是在*大水平。 在時間的第三點（3）的細(xì)胞內(nèi)鈣水平下降。 在該曲線圖在時間上的對應(yīng)點被標(biāo)記。 上部的曲線示出了340nm處的圖像的強度，中間的圖中的380nm處的圖像和下部曲線圖中，顯示了比強度。

但是，為什么需要雙激發(fā)或發(fā)射檢測？ 為什么不能簡單地衡量變化的熒光強度？

定其中的熒光團可用于檢測改變離子的水平，電壓或pH一個實驗中，發(fā)射的熒光的光的強度取決于幾個特性。這些將在下面的方程式所描述：

F =熒光強度; C =熒光濃度; D =直徑標(biāo)本（Z軸）; K =光在光通路組件的常數(shù)（單元格屬性，物鏡，過濾器等）; F（x）的介紹，如果如離子綁定或出現(xiàn)電壓/ pH值的變化給定的熒光團的發(fā)射行為。

該方程表明，光的強度在很大程度上取決于熒光團在光路中的量。 熒光團在光路中的量取決于熒光團在細(xì)胞和樣品（D）的直徑（通過標(biāo)記的攝取或表達(dá)確定的）（多個）的實際濃度（c）該被成像。 這使得它很難直接通過簡單地觀察熒光強度，例如，一個不能狀態(tài)估計一個調(diào)查離子，pH水平或電壓變化的濃度：“100強度等于游離鈣在細(xì)胞中的100nM的”。 試樣直徑（d），熒光團的濃度（c）和檢體和設(shè)置（K）的光學(xué)特性幾乎沒有可測量的，但基本上影響整體強度檢測到。 此外，它必須牢記的是，上面示出的公式為真，在檢體任何給定的點。隨著直徑（d）和熒光團濃度（C）不是均勻的整個一個試樣，甚至在單個細(xì)胞，對c和d的值可能是在檢體的所獲取的圖像的每一個像素的不同。 如果，例如在點“A”，在樣品中的細(xì)胞的直徑是相當(dāng)高的和游離鈣相當(dāng)?shù)停鈴姸瓤赡苁峭蝗缭邳c“B”，它是相對的。 實驗者然而，可能錯誤地得出這樣的結(jié)論中的鈣濃度是在這兩個地方相似，因為檢測到的熒光的光強度是類似的。

圖2：草圖上面打算說明如果在小區(qū)內(nèi)如鈣濃度由一個非比例鈣敏感的熒光團所發(fā)射的光的強度來判斷可能發(fā)生的錯誤解釋。 草圖下方的曲線代表光強度的感興趣區(qū)域（ROI）中的細(xì)胞的不同部分的區(qū)域。 
在上部圖像（A）中的細(xì)胞在不同的區(qū)室像細(xì)胞突起這往往是精細(xì)結(jié)構(gòu)（如樹突和神經(jīng)元的軸突）不同厚度（四中表現(xiàn)公式）。 作為光路內(nèi)的所有熒光團被激發(fā)光激發(fā)而其發(fā)射的光被收集，細(xì)胞的較厚部位出現(xiàn)比薄的部分更亮。 這可能導(dǎo)致的假設(shè)，即在細(xì)胞中的較厚部分中的鈣濃度比可比較薄部分更高，雖然實際的鈣濃度是相同的。 
在較低的草圖（B）不同的情況被示出。 在某些細(xì)胞類型的熒光團占據(jù)的細(xì)胞區(qū)室之間可能會有所不同。 在下部草圖的情況下，鈣濃度（C式中的）中的細(xì)胞的較厚部分較高，但在這方面的熒光團濃度較低。 作為鈣敏感染料的檢測到的熒光強度不僅取決于鈣離子濃度在細(xì)胞中，而且還對熒光團濃度，人們可能會得到的印象是，在全細(xì)胞中的鈣濃度是相同的。

為了克服這些問題，并為*離子濃度，pH水平或電壓的精確測量，比例成像已經(jīng)被開發(fā)出來。 所有比例的方法的共同之處在于發(fā)射的光的強度被測量兩次且這些強度的比（R）的計算。 取決于熒光團或所用的熒光團的組合，所述熒光團或者是激發(fā)光的兩個不同波長和發(fā)光強度的測量是在一個波長 - 或熒光團或熒光團的組合是激發(fā)光1的波長和發(fā)射的測量是在兩種不同波長的光。 這只是意味著兩個灰度值的圖像被獲取和一比圖像從它們算出。 兩個灰度值的圖像通常有不同的強度，但在圖像中的每一個像素的強度可以通過以下所示的公式來描述：(奧林巴斯顯微鏡)

F =熒光強度; C =熒光濃度; D =直徑標(biāo)本（Z軸）; K =光在光通路組件的常數(shù)（單元格屬性，物鏡，過濾器等）; F（x）的介紹，如果如離子綁定或出現(xiàn)電壓/ pH值的變化給定的熒光團的發(fā)射行為。

正如其名稱比率成像所暗示的，對于兩個同時獲得的圖像的每一個像素的比率值被計算。 例如，如果非常常用的鈣敏感染料的Fura-2（激發(fā)在340和380納米）時，所得到的方程是：

根據(jù)簡單的數(shù)學(xué)，C，D和K可以被取消，其比例是可以描述為：

虛擬比例圖像從兩個灰度值圖像計算

在實踐中，該比例是由一個計算機在一個時間推移實驗計算，在許多情況下，聯(lián)機。 通過計算相應(yīng)的兩個獨立采集灰度值圖像的像素的灰度值的比率，該比率圖像被創(chuàng)建。 請記住，灰度值的圖像基本上都是灰度值與相機分辨率的大小或感興趣區(qū)域（ROI）的區(qū)域矩陣（512×512平時，*多不*過1000×1000像素）。 在一個鈣成像時間推移實驗與染料的Fura-2（激發(fā)：340納米和380納米，發(fā)射：510納米）這會工作如下（假設(shè)該圖像具有尺寸3×3個像素）：

圖3：強度讀數(shù)值的簡化插圖CCD照相機可能使用鈣探針呋喃-2傳遞到計算機中的鈣成像實驗這一點。 在這種情況下，圖像將是3×3像素的大小。上部三個矩陣代表在鈣濃度靜止強度讀數(shù)值在340 nm和380 nm激發(fā)加上相應(yīng)的比率值。照片下三個矩陣代表在高亮像素時鈣的升高的強度值的變化。 在340nm處激發(fā)的增加值，而在380nm處激發(fā)減小的值。 但是，相對的比例值也將增加。

執(zhí)行用于每個圖像對中一個時間推移實驗的每個像素這個操作，產(chǎn)生比圖像棧。 *后，以假色圖可以應(yīng)用到比圖像棧和堆然后可以觀看并定量像正?；叶戎档臅r間推移的電影。

除了上面提到的優(yōu)點，一個比率計算具有附加的優(yōu)點。 在進(jìn)行活細(xì)胞成像與離子，電壓或pH敏感的熒光，熒光強度在相應(yīng)波長的微小變化經(jīng)常發(fā)生。 在比成像，但是，強度的增加，在一個波長和強度降低，在其它波長是在大多數(shù)情況下，觀察到的（不管探針是否被激勵或具有兩個波長檢測）。 如果這兩個獲得的圖像的比率隨后計算，基線和信號振幅之間的差將相比于熒光團的單純的強度變化被增強。 因此，比成像放大檢測到的信號的幅度。 這是用于FRET測定法特別感興趣，在那里的受體蛋白質(zhì)的下降的熒光強度和能量傳輸期間的受體蛋白的增加的熒光強度。