徠卡顯微鏡寬視場超分辨率與GSDIM

在生物學巨大進步已經能夠通過使用熒光顯微鏡。 到目前為止，圖像的分辨率由于物理限制的限制。 在過去的幾年中，新的發(fā)展方式規(guī)避這些限制，并把熒光顯微鏡分辨率的一個新的水平，提高準備在科學熒光顯微鏡。 基態(tài)耗盡其次是個別分子回報 （GSDIM）是一個本地化的顯微技術。 該技術是能夠解決細節(jié)小至20納米 。 這使得單一的蛋白質結構和生物分子在細胞研究和觀察分子過程。 之一的GSDIM方法比其它定位技術的主要優(yōu)點是，它可以用在生物醫(yī)學研究中常規(guī)應用的標準熒光標記被使用。

定位顯微鏡

常規(guī)熒光顯微鏡圖像的分辨率由衍射到所發(fā)射的光的約一半的波長的限制。 分離被緊密聯(lián)系起來的溶液是需要克服阿貝衍射極限熒光標記的結構。 *常見的*分辨方法，成像*越衍射極限的定位顯微鏡，SIM（結構照明）和STED（受激發(fā)射損耗顯微鏡）。

基態(tài)耗盡之后個別分子回報（GSDIM）是一個本地化的顯微技術。 在一般情況下，定位顯微鏡不看的同時發(fā)光熒光合奏，但清楚地分開，單獨的熒光團可與納米精度進行本地化。 隨著時間的推移，各熒光團標記的生物結構的位置被確定，并且基于每個熒光團的位置信息的圖像被重新構造，在硅片。 面臨的挑戰(zhàn)是有效地單數的熒光團的合奏，以允許單分子檢測。

GSDIM - 分子基礎

在GSDIM關鍵的一步是暫時切換大多數熒光團關閉，允許單個熒光團的精確定位。 為此，高強度的激發(fā)光被用于在該樣品中，幾乎所有熒光團變成暗這樣的方式，只留下單一的，分離良好的熒光團發(fā)出熒光，這是納米精度定位的先決條件。 

圖1（右）：基于簡化雅布隆斯基圖上的GSDIM方法的示意圖。 在熒光團離域π電子可以是，例如，在地面狀態(tài)S 0>，處于興奮狀態(tài)S 1（兩個所謂的導通狀態(tài)），或在一個三重或自由基暗狀態(tài)（均為OFF狀態(tài)）。 當熒光燈被發(fā)射時，電子在地面和激發(fā)態(tài)之間循環(huán)。 不同于這些ON狀態(tài)，在OFF狀態(tài)下的熒光團不能發(fā)光。 這些斷狀態(tài)通常是長壽命的，但它們是難以實現，作為一個系統(tǒng)間交叉是必需的。 通過設置合適的環(huán)境條件下，在包埋介質，并通過標準熒光團對于免疫熒光的明智的選擇，所以能夠可逆地關閉的熒光團通過激勵它們與一個極端的光強度。 當足夠的分子處于OFF狀態(tài)時，它能夠檢測單個分子的樣品中。

分子狀態(tài)之間的轉換

圖2：寬視場與GSDIM。 PTK2細胞。 NPC染色：抗NUP153 / AlexaFluor 532微管染色：抗β微管蛋白/ AlexaFluor 647禮貌：沃納富凱，徠卡與安娜絲卡和Jan Ellenberg，EMBL，德國海德堡協(xié)作

一旦熒光樣品通過（激光）光激發(fā)，電子被光子一躍成為*激發(fā)態(tài)。上從*態(tài)返回到基態(tài)時，光略低能量（紅移）射出。 更高的激光功率增大的光子能打到在地面狀態(tài)的電子和電子轉移到激發(fā)態(tài)的數量。 其結果是，在一給定時間的基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的采樣周期更多的電子。 發(fā)射的光子數增加和更亮的樣品可以看到。

激發(fā)光（例如，從高功率激光源）的進一步增加可以導致調光器樣品，由于減少熒光發(fā)射。 在這個過程的開始，增加激發(fā)光導致許多電子在地面與*激發(fā)態(tài)之間循環(huán)的高。 從激發(fā)態(tài)電子的一定比例進入斷電狀態(tài)。 *可訪問的子狀態(tài)從*激發(fā)態(tài)是三重態(tài)。 進入三線態(tài)需要一個自旋翻轉電子的。 旋翻轉具有非常低的發(fā)生概率，因此是一種非常罕見的事件。 由此關閉狀態(tài)實際上是未填充的樣品的低光照射。

關狀態(tài)有很長的壽命（以μs為s的范圍內），并用熒光團在關機狀態(tài)下的電子不能參與樣品的任何更多的熒光發(fā)射。 隨著時間的推移越來越多的電子*終在關斷狀態(tài)，雖然熒光團的總數并沒有改變的樣品顯示暗。 只是“主動”或“訪問”熒光數量已經改變。 在關斷狀態(tài)“泵送”電子可以被看作是一個可逆開關。 熒光團被關閉，以電子駐留在關斷狀態(tài)的時間。 當電子返回到基態(tài)時，所述熒光團被渲染“有效的”，并且可以再次發(fā)出熒光。電子的分子狀態(tài)之間的所有轉換是概率管理的進程，因此，過渡的確切發(fā)生無法預測對于給定的電子。（奧林巴斯顯微鏡）

本地化高達納米精度

對*分辨率成像的激光功率保持在一個較高的水平，直到只有幾個熒光團中的視場發(fā)射光子?！盎钚浴睙晒鈭F可以循環(huán)到地面和*激發(fā)態(tài)之間的數千倍，電子返回到關斷狀態(tài)之前產生的光子的“突發(fā)”。 光子“突發(fā)”被記錄用高敏感的EMCCD相機。 此外，只有少數電子填充的基態(tài)的時間很短，導致“基態(tài)耗盡與個別分子返回”（GSDIM）的情況。 在一般情況下，熒光團發(fā)射的光子的脈沖串在空間上完全分離，這使得在特定區(qū)域中的所有光子的單個分子的分配。 在這種情況下記錄時，衍射限制信號的中心是相同的熒光團的位置。 熒光團的位置，可以計算*多納米精度。 

圖3（右）：寬視場與GSDIM。 高爾基體膜蛋白Giantin和高爾基體基質蛋白GM130，免疫熒光染色的Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488，分別。 禮貌靖岡田博士，細胞生物學系和解剖學，醫(yī)學研究生院，東京大學，日本。

為什么有機熒光更好

一個*分辨率圖像的*終解決取決于）每個熒光基團（定位精度）和本地化的精準二）個人熒光標記的興趣（染色密度的結構）之間的*小距離。 染色密度可以影響例如通過免疫染色過程中使用更高的抗體濃度。 定位精度取決于來自體熒光收集，并可以用下式來近似的光子數量：

Δr：顯微鏡/物鏡衍射極限 
N：由一單獨的局部熒光團發(fā)射的光子數 
Δsms：個別熒光的定位精度

因此，要實現10nm的定位精度，400光子必須從用顯微鏡遞送200nm的衍射極限分辨率的熒光收集。 發(fā)射的光子的數目是在*個實例中與包埋介質組合的熒光團的性質。 作為一個經驗法則，有機熒光顯示比熒光蛋白更高的亮度和光穩(wěn)定性。 由此通過這些染料遞送光子的數目要高得多和定位精度顯著改善。 *后，一個較好的*分辨率圖像可以與“更強”染料狀有機熒光團由于改進定位精度得到！