徠卡顯微鏡在光學顯微鏡查看分辨率關于一個啟發(fā)式點

由于*分辨率已經(jīng)成為生物醫(yī)學研究中*被看好的方法之一，這個詞越來越多的歡迎。 盡管如此，有關于什么是*分辨率是什么分辨率在所有相當大的混亂。在這里，微觀解析經(jīng)典視圖討論一些技術，比傳統(tǒng)解決好了簡要介紹。 右邊的圖像示出了兩個點的距離僅僅是瑞利判據(jù)（假顏色編碼）的圖像的強度分布。

什么是分辨率？

在我們的情況下，分辨率是融合的相反。 當出現(xiàn)的東西解決了，我們就可以區(qū)分分立元件。 在顯微術，有三種主要方法用來描述分辨率。 一個是阿貝公式，阿貝的名字命名。 他在透射光中研究了線性結構

圖1：分辨率阿貝的定義。 假定樣本來代表的周期結構，有必要收集至少*衍射級以創(chuàng)建一個圖像。 因此，該鏡頭的光圈必須足夠大：N×sinα= NA≥λ/ D，帶D的空間周期。 

該圖像示出了一個光柵（上面有一些灰塵），記錄有可變光圈透鏡，調(diào)節(jié)到正好解決的結構。

對于有聚光鏡照明，分辨的*小距離到達

另一種是根據(jù)約翰W.斯特拉特，誰研究點狀發(fā)射器和定義的兩個點圖像作為光學離析，如果一個發(fā)射器的衍射圖案的*大正值的**小值，第二的衍射圖案的瑞利判據(jù)。 這導致

在這種情況下，存在兩個極大值，對應于約所述*大值強度?之間的*小亮度。

圖2：瑞利判據(jù)。 兩個點被認為是解決，如果一個點的中心落入其他點的點擴散函數(shù)（PSF）的*零。 

該標準僅適用于艾里般的專業(yè)服務公司。 萬一例如一個高斯分布的，沒有零在所有，該標準是不適用的。 其他標準，如麻雀準則將與任何概要類型工作，因為它指的是距離，其中所述圖案之間的*導數(shù)中途消失（“高原準則”）。

很明顯，當這種下降亮度甚至不太明顯點仍可以區(qū)分。 因此，一般討論的分辨率值是任意的，不能放下性質(zhì)，法律不管多少數(shù)學和衍射光學理論被應用。

第三，更實際的方法是描述在半*大值（FWHM）的全寬,其光學懸而未決的結構。 這個值是比較容易與任何顯微鏡來測量，并因此成為一種普遍接受的比較參數(shù)。 理論值是

圖3：左：由一個圓形的光圈點擴散函數(shù)（強度非線性增強，使暗淡的環(huán)可見）。 內(nèi)點稱為艾里磁盤。 右：簡介通過圓形衍射圖案的中心。 一個良好的，可衡量的特點是半*大強度全寬（FWHM =：D）。 

這一標準的優(yōu)點是，它是容易測量的副分辨率特征顯微圖像。 用于校準或極限的測量常常不同直徑的fluorochromed膠乳珠粒施加和測量。

如可以看到的，所有這些值 - 盡管具有非常不同的假設獲得 - 從平均值偏離小于10％。 這使得討論相當容易：我們知道，我們不是做一個重大的錯誤，如果我們簡單地把FWHM為觀察的分辨率參數(shù) - 這可比簡單的測量，是足夠接近

這些分辨率值，從物理和數(shù)學推導的假設時，是理論上的估算。 他們假設**的成像系統(tǒng)和光點在真空或完全均勻的襯底作為試樣。 當然，這是從來沒有在現(xiàn)實生活中的情況下，更遑論在日常實驗室操作。 一個特別嚴重的假設是，光在無限供給可用。 在現(xiàn)實中卻是沒有了，可測量的分辨率的信噪比（SNR）顯著依賴。 這也是顯而易見的，即典型的生物樣品，如腦切片做光學不表現(xiàn)為友好的真空。

基本上，測量結果，因此總是不如顯微鏡的光學分辨率。 這是要記住時，例如，檢查厚和弱染色的組織切片一個特別重要的一點！ 此外，該顯微鏡圖像是由許多衍射圖案的干擾，而不是僅僅一個或兩個而形成的。 要認真對待，分辨率測量必須始終包含大量的讀數(shù)在不同位置的（和不同的樣品中，如果可能的話），然后得到的平均值與一個錯誤。 這也是明顯的，例如，聲稱“我們已經(jīng)達到了197.48納米的分辨率”是一句廢話，而且肯定會更誠實地稱之為“200納米”。

什么是*分辨率？

前綴“*級”一詞源于拉丁文，意思是“上面”或“*越”。 因此*分辨率用于描述技術，增強了顯微鏡圖像的分辨率。 這立即導致混亂：它指的是（理論值）的光學拆分或可測量的分辨率的改進的改進當圖像被記錄時，或兩者兼而有之？ 或者，它涉及到完全不同的技術，允許使用其他方法比那些經(jīng)典的光學理論的更高的分辨率？ 在一定程度上，所有的這些技術可以合理地被稱為“*分辨率”。 無論是技術，實際上是所謂的“*解像”與否是那么的哲學的問題或有意控制的意義。 但是，讓我們離開這個討論在這里一邊贊成全面提*顯著技術。 在這里，“分辨率”和“*分辨率”之間的界限是任意的，因此全權委托。

圖像復原（卷積）

光學儀器，如顯微鏡，可視化形式不同的對象。 它是一種顯微鏡的工作來放大不能用肉眼區(qū)分，使我們可以看到它們小的結構。 不幸的是，事情總是時丟失這樣的圖像產(chǎn)生 - 我們不能不斷增加放大倍數(shù)在看到小結構的希望。 這是因為物體的微觀表示，無論多小，主要是由衍射的法律管轄。

圖4：共聚焦光學部分的圖像相比，具有細胞車廂與圖像的反褶積結果。 虛線表示在右側(cè)示出的強度分布。 表觀分辨率提高了FWHMs的比較是1.6倍。 還要注意的降噪和信號的峰值強度的增加。

因此，一個點狀的物體成像為一個衍射圖案。 這個衍射圖案是在“點擴展函數(shù)”，什么樣的顯微鏡取得這一點的三維描述。 傳播通過光學系統(tǒng)被稱作“卷積”。 它可以計算這樣的點擴散函數(shù)。 這是理想的光學和樣品的假設下計算的點擴散函數(shù)看起來很輝煌。 然而，*好是測量它們真正的樣品中，作為成像儀器和樣品的影響的所有光學像差則檢測為好。 解卷積的思想是將點擴散函數(shù)之一的知識應用于以恢復在該對象的原始光分布設置的三維記錄的圖像數(shù)據(jù)。

作為這種方法確實提高了實際記錄的圖像對象分離，去卷積有時被稱為一個類的*分辨率技術。 略低于2×橫向（x和y）方向上和略好于2×軸向改進（z）的方向權利.

共聚焦顯微鏡

在共聚焦顯微鏡中，只有一個點被照射的時間，并從該點發(fā)出的光通過一個小針孔螺紋連接到所述檢測器，具有一個幾乎點狀探測器的影響的針孔。 粗略地說，人們已經(jīng)可以從該方法推測這種類型的系統(tǒng)是固有地不易于卷積干擾：當整個領域被照亮，同時觀察到，所有的記錄的象素的數(shù)據(jù)包含其他空間元素的組分。 事實上，共聚焦成像導致非常薄的光學切片，受限衍射性質(zhì)。 對于正常的實踐中遇到的光學條件，Z軸的FWHM大約為XY值的兩倍。 傳統(tǒng)的顯微鏡 - 但是大 - 在軸向方向判斷信息的可能性。

以獲得從一個共聚焦顯微鏡中，對應于圓形孔（艾里斑）的衍射圖的使用內(nèi)部盤的針孔直徑*好的結果。 這給出了一個截面厚度接近衍射極限，而不會丟失太多的光。 這是不可能的，以改善這樣的條件下的橫向分辨率。

圖5：分辨率表演在一個真正的共聚焦（單點）顯微鏡針孔直徑的函數(shù)（改編自曲線。光學切片性能示于黑色，紅色的橫向分辨率。 如果針孔具有衍射圖案（1 AU由灰色線表示）的內(nèi)盤的大小，進一步關閉并不能改善切片，但會增加橫向分辨率。 在針孔零，切片厚度將假設的衍射極限，并且相比于廣角衍射極限的橫向分辨率是由√2倍更好。

所以，經(jīng)典的共聚焦圖象不*分辨率圖像至于橫向分辨率。 然而，橫向分辨率由針孔光闌進一步收窄改善。 對于針孔的（當然只是理論上的）的情況下，直徑為0，約1.4×的改進可以預期如圖5中間（分1 AU-共聚焦），改進是可能的。 臭名昭著敏感熒光的樣品，依靠高傳輸光學部件（AOBS和SP檢測器）和一個敏感的傳感器（在此，路政署是選擇）。 的優(yōu)點在于，沒有其它的修改是必要的，除了經(jīng)典的共聚焦顯微鏡（提供的設計滿足上述提到的條件）。

分辨率在上述定義的意義上說，可以附加地通過隨后的解卷積來增強。 在這里，高效率和探測器靈敏度有積極的作用，同樣，如去卷積算法期望適當高信噪比。

圖像掃描顯微鏡

另一個想法改善共聚焦顯微鏡的分辨率被命 名為“圖像掃描顯微鏡”或“重新掃描共聚焦顯微鏡”。這種方法利用了以下事實：在一個共聚焦顯微鏡的圖像點的FWHM是稍窄中央衍射外盤比在中心的優(yōu)勢。 基本上，這是相當于觀測一個中心位置很差針孔導致比井中心1稍好分辨率 - 盡管這是以巨大成本的強度。

理論上，人們可以預期在大約1.5×橫向分辨率的增益，如果記錄在許多信道的整個衍射圖像，然后分發(fā)到強度“正確”的像素。 然而，這僅適用于檢測器上一個無限大的面積無限數(shù)量。 在實踐中，這一因素是顯著小。 如果有改進*過1.5×（例如1.7倍）一個要求，他們使用的是圖像掃描和去卷積的組合。 順便提及，這樣的顯微鏡失去能力，以產(chǎn)生光的部分，作為衍射圖案作為整體不再切斷。 如果一個人想恢復光學切片能力，就必須限制在檢測到的衍射圖案的區(qū)域中，以例如1.25 AU。 然而，這是幾乎相同的普通共聚焦顯微鏡用1.0 AU。 特別是，1.0和1.25 AU之間的強度分量僅為2％，作為一個零點交叉在1 AU; 上面和下面它也沒有太大的強度。

圖6：左：共聚焦（紅色和黑色曲線）和再掃描（藍色和黑色曲線）橫向和軸向性能比較。 重新掃描數(shù)據(jù)適于由。如果覆蓋1.25 AU衍射圖案的一小部分被用于重新掃描（藍色圓圈），橫向分辨率提高了一點，但是該切片是顯著惡化。 當在0.6 AU（紅色圓圈）記錄共聚焦，橫向分辨率良好改善，并且切片性能接近衍射受限。 右：在圓形的PSF（黑色）和集成能量隨半徑的區(qū)域的徑向強度（對應于針孔直徑）。 從1 AU焦點能量VS 1.25 AU分數(shù)只有約2％的不同。

另外，這種儀器的設計通常是充滿從記錄象素的分割產(chǎn)生的其他損失。 這些損失容易加起來總強度的三分之一 ，因此比普通的共聚焦顯微鏡更大，例如，用≈0.6 AU的針孔直徑！

結構照明

另一個不同的方法是使用結構照明的技術。 這可以通過查看所謂云紋圖案，其由突出于彼此以不同的角度的頂部的兩個條紋圖案形成來理解。 如果一個人知道的條紋圖案中的一個，并測量了莫爾圖案，所以能夠計算出其它的條紋圖案。 這是結構照明顯微鏡的情況完全相同。 在已知的條紋圖案是ILLUMI國，形成時的照明被折疊與該對象的結構的圖案可以與一個攝像機來測量。 的兩條信息，然后采取以重構第三，即結構信息。 要做到這一點，然而，人們必須在至少三個不同的照明方向和三相錄制圖像。 更好的結果都與5個方向和5個階段，這意味著25個圖像記錄完全實現(xiàn)。 自然地，這需要一些時間，也科目所述樣本以相當大的風險。 分辨率的增益是大約2倍。

到目前為止，所有描述的方法顯示細節(jié)知名度的潛在的改進，在實現(xiàn)兩倍的分辨率之*。 因此，假設的約200nm為傳統(tǒng)的顯微鏡的值（使用綠光和為1.3數(shù)值孔徑的物鏡）的*好的一個可以希望用這種方法是100nm的分辨率。 下面的方法是在原則上是無限的。 決議實際達到只依賴于參數(shù)設置，樣品的效率和發(fā)射器本身的尺寸。

定位顯微鏡

一個點的圖像通過衍射圖案進行說明。 在具有圓形孔的顯微鏡的情況下，這是艾里圖案。 如果一個人可以合理地，一個光點來自于一個單一的發(fā)射器（“單分子顯微鏡”），可以測量產(chǎn)生的艾里人物，演繹排放焦點。 一者來確定所述熒光電子系統(tǒng)的中心，因此。

有多種方法用于確保真正獨立的發(fā)射器被測量。 如果衍射圖中重疊，但仍然可區(qū)分正因為如此，它們可以位于與分離算法。 它們可以被識別為單獨的實體通過顏色編碼，例如，或不同的閃爍頻率。 在時間的分離是*常見的方法中，其中所述發(fā)射器被打開或關閉。 也有此各種開關選項：漂白（僅關斷），從暗狀態(tài)隨機返回中，兩個非發(fā)光部分的分子，由另一染料分子的滅火隨機遭遇，有源開關具有不同光子能源等。 的結果始終是一個（至少暫時地）分離發(fā)射器的熒光形成在照相機芯片的艾里圖案。

圖7：單發(fā)射器的定位精度。 一）一個發(fā)射器（紅十字會）在廣場中心的理論PSF。 雙箭頭指示的分布（r）的大小，由該衍射圖案給出。 b）在一系列單獨的排放藏品，三）協(xié)調(diào)優(yōu)勝劣汰PSF→（綠十字），D）的測量誤差這里顯示的例子的中心。 平均誤差是成反比的光子貢獻的測量的數(shù)量。

精度與該衍射圖中，可以再次確定的中心取決于衍射圖案本身（由發(fā)射波長和物鏡的數(shù)值孔徑確定的）的尺寸和上，可以在記錄過程中被收集光子的數(shù)目單個圖像的。

光子的數(shù)字越高，則較好的精確度，實際上它在理論上是可能實現(xiàn)無限的精度。

所以，對于給定的光的無限量的位置精度沒有物理限制。 這種位置測量的坐標被傳輸?shù)綀D像存儲器和重復測量經(jīng)常（幾千圖像）與發(fā)射器開啟以隨機，以獲得熒光分子分布的相干圖像。 相同的發(fā)射器（具有不同的結果）的多個測量值不能被排除。 在這樣的圖像分辨率，然后由上述的位置精度來決定。

STED顯微鏡

*種方法來描述理論上是無限的分辨率使用一種現(xiàn)象叫做“受激發(fā)射”。這里，觸發(fā)光子激活熒光染料的從激發(fā)到基態(tài)的躍遷。 每個激光發(fā)生這種現(xiàn)象的優(yōu)勢。 如在“共聚焦顯微鏡”所描述的，共聚焦激光掃描顯微鏡照射只受衍射限制區(qū)域在任何一個時間。 這一地區(qū)是輻射的原因，它的大小決定了分辨率。 因此，減小了尺寸理論上應該導致更高的分辨率。 用受激發(fā)射的技術，激發(fā)態(tài)可以發(fā)射過程發(fā)生之前熄滅。 所以，當光即適合觸發(fā)激發(fā)射被引導到與激發(fā)射器的區(qū)域，在這個位置上的激發(fā)態(tài)可以被消滅或防止。 從該技術獲益，人們必須確保該耗盡激光聚焦在周圍的艾里圖案的中心的環(huán)狀。 否則，當然，所有的熒光染料將受到影響，也沒有更多的圖像可以被記錄。 這種類型的圓形衍射圖案是比較容易實現(xiàn)通過將相位片插入照明光路。

圖8：在STED顯微鏡的衍射極限光點（上圖）的激勵。 藍色區(qū)域是由一個衍射受限的圓形光學產(chǎn)生受激分子的區(qū)域照亮。 照明用環(huán)形聚焦在受激發(fā)射觸發(fā)波長擦除激發(fā)區(qū)域外的特征，留下一個小區(qū)域為發(fā)射其導致增加的分辨率。

殘余區(qū)域現(xiàn)在取決于激勵面積與滅火環(huán)的“厚度”的比率。 這個尺寸是由衍射參數(shù)波長和數(shù)值孔徑再次確定。 此外，然而，它也由施加到該環(huán)形聚焦的能量來確定。 在此焦點的能量被耗盡激光的功率統(tǒng)治。 從理論上講，激光能量可能會承擔什么價值 - 只有一個限制由目前的技術發(fā)展。 的受激發(fā)射損耗技術，因此不被衍射限定。（奧林巴斯顯微鏡）

實際上決定了分辨率提高效率，在一個給定的損耗激光能量參數(shù)，為飽和強度I 周六 這是一個參數(shù)是由熒光染料的光物理控制。 比I / I中的阿貝式模型的分母適當?shù)暮谋M的影響坐著實現(xiàn)。

圖9：關于增加枯竭激光在顯微鏡STED影響。 *列：激發(fā)區(qū)域。 本是恒定的所有實施例，作為激發(fā)強度不改變。 第二列：視圖耗盡激光的強度增加，從上到下的衍射圖案。 第三列：激發(fā)和枯竭的疊加。 第四柱：殘余激勵區(qū)域，這降低了與日益枯竭功率。 理論上提供衍射限制的分辨率。

STED提供了許多優(yōu)點，這使得它對于現(xiàn)代醫(yī)學和生物學研究的理想工具。 首先：它是一個即時的方法。 在一次掃描生成圖像 - 隨后的數(shù)量沒有記錄成千上萬的圖像運算，因為它是與定位技術的情況。 這是為生命成像以高幀頻，試圖做生理相關的實驗時，一絕至關重要。 此外，還可以組合一系列不同熒光的，對于在空間和時間上信號的相關的一個先決條件。 雖然系統(tǒng)是一個不小規(guī)模的顯微鏡，這有一個很好的理由。 作為一個共聚焦掃描顯微鏡的衍生物，共聚焦顯微鏡固有包括作為替代的成像方法。