奧林巴斯顯微鏡的漂白

奧林巴斯顯微鏡的漂白

當熒光團永久性地失去由于熒光向光子誘導化學損傷和共價修飾的能力漂白的現象（也通常被稱為衰落 ）發(fā)生。 當從激發(fā)單重態(tài)到三重態(tài)的躍遷，熒光團可以與另一個分子相互作用以產生不可逆的共價修飾。 三重態(tài)是相對長的壽命相對于單重態(tài)，從而使受激分子一個長得多的時間內經受化學反應與環(huán)境中的部件。 的發(fā)生為光漂白前的特定熒光團的激發(fā)和發(fā)射周期的平均數目是依賴于分子結構和當地的環(huán)境。 某些熒光漂白迅速發(fā)出只有幾個光子后，而其他人都更強大的可漂白前經過成千上萬次的。 這種互動式的教程探討變化中的漂白率在單，雙，和乘熒光標記標本。

本教程初始化一對出現在本色形象和光漂白圖像窗口相同的熒光圖像。 為了操作教程，點擊快門按鈕以極大的夸張速度在一個固定的時間內打開虛擬快門，讓光漂白圖像圖像褪色或光漂白。 褪色可以在任何時候通過點擊暫停按鈕（這成為一個開始按鈕）暫停，然后繼續(xù)單擊開始按鈕。 在雙和三標標本，各種單獨的熒光漂白率可以單獨使用顏色通道復選框被看作（默認設置是所有通道打開）。 例如，點擊與三重標記標本紅復選框，將只顯示紅色通道。 兩個或所有三個顏色通道的可混合在一起使用添加復選框乘法標記標本。 一個新的樣本可以使用選擇的樣本下拉菜單中選擇。 樣品名稱包括以下熒光團標記信息：FITC，熒光素異硫氰酸酯;三 ，紅色，綠色和藍色熒光團; 雙 ，兩種熒光團; DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基; MitoTracker，線粒體探針;Alexa的488，綠色熒光; 和自動 ，自發(fā)熒光。 本教程的目的是在裝上隨機改變光漂白率個別熒光，使點擊快門按鈕，反復將演示如何將圖像顯示為熒光漂白率的變化對每個顏色信號。

因為光漂白，非常了解甚少的現象，導致熒光發(fā)射強度的大多數試樣急劇損失，控制該工件是為了成功地捕捉到了良好的圖像的關鍵。 作為一個典型的熒光染料的例子中，量子產率的熒光素在中到高照度光漂白決定了的平均分子將發(fā)射在其使用壽命為30至40000光子（變得永久禁用之前）。 此外，激發(fā)和發(fā)射周期的數目是恒定的一個給定的熒光團不論激發(fā)能量是如何傳遞，無論是在離散的脈沖，或通過連續(xù)的照明。 因此，通過使用中性密度濾光片不阻止光漂白減少激發(fā)光的水平，它僅僅降低的速率。（奧林巴斯顯微鏡）

示于圖1是光漂白（衰落）的一系列在小鼠小腸的乘法 - 染色的低溫恒溫器薄膜部（16微米）的不同時間點拍攝的數字圖像的觀察的一個典型的例子。 分別對細胞核進行染色，SYTOX綠（綠色熒光），而杯狀細胞，并在刷狀緣的絲狀肌動蛋白的粘液沾滿的Alexa Fluor 350麥胚凝集素（藍色熒光）和Alexa Fluor 568鬼筆環(huán)肽（紅色熒光）， 。 時間點采取了使用與帶寬調整為同時激發(fā)三個熒光同時記錄相結合的發(fā)射信號的熒光濾鏡組合兩分鐘的間隔。 需要注意的是所有這三個熒光團具有相對高的強度在圖1（a），但將Alexa Fluor 350和568（藍色和紅色）的強度開始兩分鐘迅速下降，并幾乎完全消失了以六分鐘。 綠色染色的核是漂白更耐磨，但它們的強度也下降穩(wěn)步在定時序列（10分鐘）的過程中。 各種各樣的合成的抗褪色試劑將顯著減少漂白率。

漂白事件的一類重要的是光動力 ，這意味著它們涉及熒光團與光和氧的組合的相互作用。 熒光團和分子氧之間的反應永久性破壞熒光并產生游離基的單線態(tài)氧物種可化學修飾的其它分子中的活細胞。 漂白由于光動力學事件的量的分子氧濃度和熒光團之間的距離近，氧分子，以及其它細胞組分的函數。 漂白可以通過限制熒光團的曝光時間的照射或通過降低激發(fā)能量被減少。 然而，這些技術也降低了可測量的熒光信號。 在許多情況下，熒光團或細胞懸浮液的溶液可以是脫氧，但是這不是對活細胞和組織是可行的。 也許對漂白最好的保護是限制熒光激烈照明（使用中性密度過濾器）再加上明智地使用可添加到安裝溶液或細胞培養(yǎng)基中可商購的抗褪色試劑曝光。

在某些情況下，光漂白作用也可以用于獲得該否則不會提供特定的信息。 例如，在光漂白（FRAP）實驗后的熒光恢復，目標區(qū)域內的熒光團被有意漂白照射過量。 隨著新的熒光團的分子擴散到檢體（恢復）的漂白區(qū)，所述熒光發(fā)射強度進行監(jiān)測，以確定目標熒光團的橫向擴散速率。 在這種方式中，熒光標記的分子的平移移動性可以在單個細胞或活組織的部分的一個非常小的（2?5微米）的區(qū)域內被確定。