徠卡顯微鏡適合RNA探針

簡介

什么是RNA？

核糖核酸簡稱RNA。 這些分子是必不可少的生活的幾乎所有的工序，因為它們介導(dǎo)的所有步驟的基因表達的：信使RNA（mRNA）從基因轉(zhuǎn)錄，攜帶信息出細胞核。 在轉(zhuǎn)錄真核生物中，mRNA的成熟，其中涉及拆除插序列（內(nèi)含子）的。 這個過程 - 被稱為拼接 - 主要是通過SN /含üRNA剪接體介導(dǎo)的。 在從核出口，大部分的mRNA翻譯得到的含rRNA的核糖體 - 該代碼是通過攜帶激活的氨基酸合成蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運RNA解釋。 微RNA，短干擾RNA和的piRNA - 翻譯和特定mRNA的壽命部分由短RNA控制的。 不僅上述的RNA種類，但實際上該基因組的大部分被轉(zhuǎn)錄 - 其中的意義目前正在積極研究。

什么是顯微鏡都與RNA？

近三十年前，被發(fā)現(xiàn)β-actin基因分子被不均勻雞成肌細胞和成纖維細胞的細胞質(zhì)中本地化。 很快，在其他模型系統(tǒng) - 許多其他的例子，如芽殖酵母，果蠅和非洲爪蟾卵母細胞和哺乳動物成纖維細胞和神經(jīng)元 - 緊隨其后。 最近，在果蠅胚胎和卵母細胞的RNA本地化的全基因組的研究表明，所表達的轉(zhuǎn)錄物的大部分（高達80％）分布于細胞質(zhì)內(nèi)的獨特的，非均勻的圖案。 此外，盡管是微小的，沒有明確定義的細胞器，細菌被證實為表達本地化的表達。

將近十年前，所推出的單分子敏感性顯微技術(shù)，它成為可以測量絕對RNA的數(shù)量 - 通過計算RNA分子 - 以前所未有的細胞或亞分辨率。 這些技術(shù)是目前允許各個單元的“深轉(zhuǎn)錄組測序”的顯微鏡載物臺的邊緣。

當(dāng)然，顯微鏡，不僅提供了快照 - 位置和號碼 - RNA分子，但有合適的成像方法，轉(zhuǎn)錄深刻的機制，RNA本地化，翻譯和衰變被發(fā)現(xiàn)。

你怎么能想象RNA？

核糖核酸 - 類似于DNA和多肽 - 是聚合物大分子。 其身份是由主結(jié)構(gòu)或積木序列中，核糖核苷酸（A，C，G和U）來決定。 大多數(shù)的RNA分子是單鏈的 - 雖然它們折疊成復(fù)雜的二級和三級結(jié)構(gòu)往往涉及形成分子內(nèi)雙鏈體 - 從而他們的身份可以與匹配互補序列進行探測。 這些探頭大多是單鏈自然的核酸 - 單鏈DNA或RNA - 攜帶一些檢測標記，從放射性同位素，小，免疫檢測的分子 - haptenes - 或熒光染料。 期間稱為原位雜交（ISH）的方法，該探針找到并結(jié)合其靶RNA。 不匹配的無雜交通常更穩(wěn)定能量上比從而通過在一個特定信號被開發(fā)的ISH方法適當(dāng)?shù)南礈觳襟E被探針形成的，其他的，非特異性復(fù)合物是。 然而，由于這些強制性分化步驟： - 在惡劣治療旁一些ISH協(xié)議要求（使用高溫，有機溶劑，高鹽等） - 沒有這些ISH技術(shù)是與生活細胞成像相容。

那你怎么跟著RNA住在哪里？

RNA永遠存在“裸”細胞內(nèi)的 - 它總是在復(fù)雜的一組動態(tài)的蛋白質(zhì)分子形成核糖核蛋白顆粒（的RNP）。 許多這些蛋白質(zhì)分子的結(jié)合的核糖核酸直接（限制性商業(yè)慣例）。 融合這些限制性商業(yè)慣例到熒光蛋白（FPS）是一種廣泛使用的方法來可視化的RNA活。 大多數(shù)這些限制性商業(yè)慣例，在真核細胞的劇目發(fā)現(xiàn) - 例如詩道芬，eIF4AIII，Hrp48A，PABP等，限制了目標特異性和任何給定的RNP只是兼職居民。 然而一些限制性商業(yè)慣例，如Pumillio同源域（PUM-HD）或CRISPR / Cas9，可以工程化以匹配給定的RNA靶。 然而，為了有效地顯現(xiàn)mRNPs - 通常含有單個mRNA分子 - 每個粒子幾個拷貝的RBP-FP融合體是必要的。 為了最大限度地減少每靶分子轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的數(shù)量，在體內(nèi)的RNA可視化技術(shù)的最常用的利用限制性商業(yè)慣例直系到主機。 第一他們的種類是MS2系統(tǒng)，由6-24份的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特定于MS2噬菌體和匹配的MS2外殼蛋白融合至FP串聯(lián)排列的。 通過引入MS2循環(huán)數(shù)組復(fù)制到目標ASH1 mRNA和封存未綁定的MCP-FP到細胞核，歌手實驗室可以想像生活中的芽殖酵母動態(tài)ASH1 mRNPs。

這些噬菌體環(huán)/環(huán)結(jié)合外殼蛋白系統(tǒng)的一個共同的缺點是它們依賴于RNA靶的轉(zhuǎn)基因修飾 - 大多引入另外的額外拷貝的內(nèi)源性本兩個等位基因 - 和回路裝入外套陣列蛋白加入約1.5-2丙二醛到感興趣的RNP的大小。 這些變化可能會影響目標限制性商業(yè)慣例的動力（轉(zhuǎn)錄，運輸，翻譯和衰減），因此，理想情況下，所得到的結(jié)果應(yīng)該與其他獨立，互補的方法進行驗證。

然后，還必須有其他的方法來遵循的RNP生活。 他們?nèi)绾螐囊郧暗挠惺裁床煌?/span>

1996年，特亞吉實驗室介紹分子信標（MBS），率先采用熒光探針。 MB都是短寡核苷酸探針用熒光團和淬滅劑對，在其兩個相對的末端。 這些末端（通常為6-7個核苷酸）是彼此互補的形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)從而定位所述熒光團旁邊的猝滅劑（暗狀態(tài)）。 于MB的目標特定中間部分（環(huán)）的雜交，所述發(fā)夾的莖被熔化，分離熒光團和淬滅劑，從而產(chǎn)生活化的熒光（亮狀態(tài)）。 使用的MB - 熒光探針在一般的 - 不要求區(qū)分洗滌步驟和目標的無轉(zhuǎn)基因修飾。

不幸的是，RNA / DNA雜交也不雙鏈RNA 在體內(nèi)穩(wěn)定。 為了解決這個問題，這些探頭的骨干進行化學(xué)修飾以隱藏細胞內(nèi)核酸形成的混合體。 作為正副作用，這些修改 - phosphoribose骨干大多2'O甲基化和/或鎖核酸摻入 - 增加的混合動力車允許較短的探針的穩(wěn)定性。

FIT探頭

什么是FIT代表什么？

噻唑橙（FIT）的強制插是另一種方式來獲得熒光探針。 這些探頭，由Seitz的實驗室開發(fā)，包括嵌入DNA染料，噻唑橙（TO），為堿替代 - 即更換非端子座中的寡核苷酸序列。 這種染料是一種低粘度的環(huán)境的非熒光時，例如在溶液（暗狀態(tài)）。 在探針的雜交，兩側(cè)堿基對的氫鍵大大限制了染料的扭轉(zhuǎn)運動，從而迫使它變成像狀態(tài)的插層，活化熒光（亮狀態(tài)）。 其結(jié)果是，F(xiàn)IT探針 - 不像的MB - 對不匹配非常敏感 - 特別是對那些在于：緊鄰。

圖1：（一）單一到，（B）增加一倍，和（C）東條標記的DNA FIT-探針的示意圖。 資料來源：H?velmann等人，2013。

做這些散客探頭“樣子”？

一個熒光報道的最重要的性質(zhì)是亮度。 于：（量子產(chǎn)率）的發(fā)射在很大程度上取決于它的微環(huán)境; 不僅在探針的雜交的狀態(tài)，而且還對位置和的鄰居核苷。 在明亮的狀態(tài)下，F(xiàn)IT探針雜交互補的單鏈DNA分子的典型亮度大約是7-14毫升?摩爾-1?-1，周圍20-40％的的綠色熒光蛋白和AlexaFluor 488的10-20％。然而，成像的另一個關(guān)鍵參數(shù)是此相反，即信號到其直接背景的比值。 雖然傳統(tǒng)的熒光團 - 像綠色熒光蛋白或AlexaFluor 488 - 都同樣明亮獨立地綁定到目標或解決方案，以黑暗狀態(tài)標記FIT探針是8-20倍，比他們的明亮狀態(tài)（響應(yīng)）調(diào)光器。 此屬性使FIT探針適于例如執(zhí)行原位雜交（FISH），即使在其他方式挑戰(zhàn)組織例如果蠅子房快速洗無熒光的。

圖2： 奧斯卡 mRNA在顯影果蠅卵室清洗-自由FISH：蛋室包含顯影卵母細胞（*），可以豐富奧斯卡的mRNA最終在后極（在asterixes的右側(cè)）。 該mRNA許多人一樣是15護士細胞（左到卵母細胞）的乘積。 這16種系細胞被包封的體細胞濾泡epithelium.Source的單層：H?velmann，2013。

您可通過將多個每個探頭染料更亮FIT探頭？

不是真的 - 因為這些探針是短，典型地15-30個核苷酸長（5-10納米），兩個或更多的熒光團被定位以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移的（FRET）的范圍內(nèi)，從而淬火彼此，導(dǎo)致只有20亮度增加-40％。 但是，我們設(shè)法增加一倍的亮度（約24-28毫升?摩爾-1?-1）通過引入一個稍微紅移和明亮的熒光，惡唑（JO）進入到包含F(xiàn)IT探頭。 JO，而被嵌入染料，是相當(dāng)明亮，即使在溶液中; 這是它具有低響應(yīng)速度。 在單鏈探針，然而，為了有效地猝滅JO碰撞。 雜交導(dǎo)致亮狀態(tài)。 由于所形成的雙鏈體的剛性，TO不再猝滅JO。 相反，激發(fā)能量通過FRET傳遞從TO到JO，恢復(fù)JO的最大亮度。

另一選項以增加單個FIT探針的亮度是增加所經(jīng)歷到本地約束。 我們表明，引入鎖核酸（LNA）的3'，以加倍的給定探針的最大亮度，同時它離開響應(yīng)有效不變。 這種效應(yīng)是由于到LNA引起的減少堆垛層相鄰堿基之間的距離在雙面增加當(dāng)?shù)卣扯取?/span>

圖3：由LNA減少堆疊距離增加本地粘度。 資料來源：H?velmann和加斯帕，2014年。

你可以用這樣的亮度提高了適配性探頭的RNP體內(nèi)成像？

幾乎-在探頭骨干單一LNA的修改并沒有賦予足夠的核酸酶抵抗形成復(fù)式然而，與核糖（mixmer設(shè)計）的2'OH額外的甲基化，探頭被注入果蠅后保持穩(wěn)定了一個多小時卵母細胞。 此外，一個探頭很少是足夠明亮，顯示個別的RNP。 通過將三至五個不同的mixmer探頭對奧斯卡的mRNA，我們設(shè)法獲得亮度和對比度相似，10倍MS2標簽標有MCP-EGFP轉(zhuǎn)基因奧斯卡的RNP。

4A

圖4：RNA體內(nèi)成像：靶向奧斯卡 mRNA的3 mixmer FIT探頭的混合物注入生活，野生型卵母細胞（G，箭頭標記） 奧斯卡 RNP運動（H，箭頭）可以遵循后甚至50分鐘。注射。 ，比例尺代表50微米和5微米的G和H分別。 資料來源：H?velmann和加斯帕，2014年。

你怎么知道注射的探頭還沒有目標上的影響？

我們使用上述oskarMS2（10X）/ MCP-EGFP系統(tǒng)，我們和其他人有據(jù)可查，作為參考。 同時注入所有五個mixmer探測即使，我們觀察到奧斯卡 RNP活力無顯著差異相比，oskarMS2。 當(dāng)這樣一個獨立的分析是不可用時，一個很好的做法可以測試多種不同的FIT探頭不同的組合。

當(dāng)然，并不是所有的探頭是惰性的。 通過靶向已知雙鏈二級結(jié)構(gòu)為奧斯卡 mRNA定位（一個所謂的定位元件）與mixmer探針互補的鏈（osk6）之一重要，我們誘導(dǎo)的奧斯卡 RNP蠕動相同的缺陷如先前的報導(dǎo)一系列突變奧斯卡轉(zhuǎn)基因的。 所述基于FIT探針操縱不僅少得多耗時比產(chǎn)生和分析的RNA的轉(zhuǎn)基因拷貝，而且只有在RNP生物合成的特定步驟的效果 - 在運輸，在這種情況下。 突變，在另一方面，可能影響從轉(zhuǎn)錄命運mRNA的開始，并且因此，所觀察到的表型可能是由于一系列的缺陷的總和。

圖5：干擾使用RNP功能FIT探頭：本osk6 FIT探測目標的拼接奧斯卡本地化元素。 正如看到的TO通道（A和B）一個探頭不夠足夠明亮按照個人的RNP，但是，它會報告成功定位。 上的時間突起oskarMS2（10倍）/ MCP-mCherry（A'和B'）不存在長單向奧斯卡 mRNPs（箭頭）的游程可以理解。 比例尺條為5微米。 資料來源：H?velmann和加斯帕，2014年。

總之，仔細選擇FIT探針是RNA可視化不僅是一種工具，但也RNP功能的發(fā)現(xiàn)。

您可以將這些探頭與其他活細胞標記，如FP標簽蛋白？

是的，可以。 由于大多數(shù)模式生物必須通過（E）綠色熒光蛋白標記的融合蛋白目前龐大的圖書館，這是至關(guān)重要的我們找到條件下，這兩個熒光團 - EGFP和TO - 可以共同觀察。 相比于：綠色熒光蛋白的吸收和發(fā)射光譜是足夠紅移，與仔細地選擇激發(fā)光 - 470毫微米為EGFP和525納米為TO - 有幾乎在一個順序掃描的兩種分子之間沒有串?dāng)_。 這些激發(fā)波長似乎有點異國風(fēng)情 - 事實上，這樣的雙彩色成像，我們用一個國家的最先進的徠卡共聚焦顯微鏡配備了超連續(xù)光源。 自然，我們首先使用了oskarMS2（10倍）/ MCP-EGFP系統(tǒng)與FIT探針組合來檢查用于共標記和兩個信號的共遷移。

圖6：吸收和GFP的發(fā)射光譜和TO：吸收（虛線）和發(fā)射（實線）的GFP（藍色）和TO（紅色）的光譜。 的激發(fā)和耗盡激光線波長由垂直實線表示。

更有趣的應(yīng)用，但是，是測試的共定位用期間的RNP的生物合成，可能有功能的蛋白質(zhì)。 經(jīng)典，這些發(fā)現(xiàn)在連接質(zhì)量生化分析完成。 鏡，然而，有明顯的優(yōu)點超過這樣的分析：它可以定義的地點，時間及有關(guān)的相互作用的動力學(xué)。 不幸的是，體RNP通常比衍射極限小，只包含少數(shù) - 也許只有一個副本 - 一個給定的限制性商業(yè)慣例的。 因此，大多數(shù)免疫染色勢必造成點狀非特異性標記 - 即使特異性抗體 - 真正的RNP來自非特異性的背景難以區(qū)分。 EGFP融合蛋白的自發(fā)熒光，在另一方面，有一個幾乎百分之百的特異性和少至單個GFP分子可與當(dāng)今最靈敏的檢測器來檢測。

圖7：瞄準奧斯卡 mRNA和核周GFP FIT探針成像單獨使用相同的成像設(shè)置：GFP之間串?dāng)_。 有幾乎EGFP和TO之間無串?dāng)_。 資料來源：伊姆雷·加斯帕，未公布。

如果體RNP是如此之小，你有沒有考慮到的超高分辨率成像？

事實上 - 主要不是因為RNP大小，但因為擁擠，他們可以在某些位置實現(xiàn)。 因為果蠅卵室是一個相當(dāng)厚的樣品（100微米沿軸向軸）和有趣的部分是從玻璃表面通過10-15微米厚的層細胞的分離，這限制了方法的選擇。我們發(fā)現(xiàn)，STED顯微鏡這些條件下工作。 LNA改性FIT探針已被證明是優(yōu)良的受激發(fā)射損耗的標簽，因為在雜交時不僅它們的亮度，而且熒光壽命顯著增加，并且因此門控STED進一步提高了檢測的信號的靶特異性。 因為在EGFP和TO的發(fā)射光譜重疊的同時，一個單個592納米的激光耗竭足以實現(xiàn)雙色STED成像。 雖然樣本范圍最大橫向分辨率為約80-120納米，無論是個人的RNP和RNP子光散射決心做更詳細比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡。 這種成像使我們能夠進行精確的基于對象的共定位分析。

圖8：奧斯卡 mRNPs的STED成像：五LNA修飾FIT探針的混合物用于固定的果蠅卵巢。 中間oogenetic卵母細胞后極進行成像共聚焦，然后用門控STED設(shè)置。RAW圖像進行反褶積與惠更斯專業(yè)。資料來源：伊姆雷·加斯帕，未公布。

圖9：雙色STED：標有核周型綠色熒光蛋白（綠色）和瞄準奧斯卡的mRNA（品紅色）FIT探頭護士細胞的核信封。資料來源：伊姆雷·加斯帕，未公布。