如何計算徠卡顯微鏡的分辨率
在顯微術(shù)中，術(shù)語“分辨率”用于描述顯微鏡區(qū)分細節(jié)的能力。換句話說，這是通過觀察者或顯微鏡攝像機仍然可以看到樣本的兩個不同點的*小距離 - 作為單獨的實體。
顯微鏡的分辨率與光學部件的數(shù)值孔徑（NA）以及用于檢查樣品的光的波長本質(zhì)上相關(guān)。此外，我們必須考慮由恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）于1873年首次描述的衍射極限。
本文涵蓋了這些概念背后的一些歷史，并解釋每個使用相對簡單的術(shù)語。
分辨率和數(shù)值孔徑
數(shù)值孔徑（NA）與光通過的介質(zhì)的折射率（n）以及給定物鏡（NA = n x sinα）的角孔徑（α）有關(guān)。顯微鏡的分辨率不僅僅取決于物鏡的NA，而是考慮到顯微鏡聚光鏡的NA，整個系統(tǒng)的NA。更多的圖像細節(jié)將在其中所有光學部件正確對準，具有相對較高的NA值并且彼此協(xié)調(diào)工作的顯微鏡系統(tǒng)中被解決。分辨率也與用于對樣本成像的光的波長有關(guān); 較短波長的光能夠比較長的波長分辨更多的細節(jié)。
在處理決議時需要考慮三個數(shù)學概念：“阿貝衍射極限”，“艾里光盤”和“瑞利標準”。這些都按時間順序列在下面。
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喬治·比德爾·艾利和“艾利斑”（1835）
喬治·比德爾·艾利（George Biddell Airy 1801-1892）是英國數(shù)學家和天文學家。到1826年（25歲），他被任命為三一學院數(shù)學教授，兩年后，他被任命為新劍橋天文臺的天文教授。從1835年到1881年，他是“天文學家皇家”，他有一個月球和火星火山口以他的榮譽命名。
同樣在1835年，他在劍橋哲學社會交易會上發(fā)表了一篇題為“關(guān)于圓形玻璃的衍射”的論文。艾里從天文學家的角度非常地寫了這篇文章，他描述了“在一個好的望遠鏡上看到的星星的形象和光線的形狀和亮度”。盡管在不同的科學領(lǐng)域?qū)懽?，但這些觀察結(jié)果與其他光學系統(tǒng)和顯微鏡相關(guān)
的艾里斑是可以通過一個圓形孔在通過衍射限制的完全對準的系統(tǒng)來確定的光的*佳聚焦點。從上圖（圖1）可以看出，這是一個亮點，它們是同心環(huán)或波紋（更準確地稱為通氣圖案）。
衍射圖案由光的波長和光通過的孔的大小確定。Airy Disc的中心點包含大約84％的發(fā)光強度，其余16％在衍射圖案周圍。當然，用顯微鏡觀察到的樣本中有許多光線，而且像“Airy Disc”一詞所描述的那樣，更適合多種艾里模式而不是單點光。
如圖1下半部分所示的艾里模式的三維表示也稱為“點擴展函數(shù)”。
恩斯特·阿貝和“阿貝的衍射極限”（1873）
恩斯特·卡爾·阿貝（Ernst·Karl·Abbe 1840-1905年）是德國數(shù)學家和物理學家，1866年，他遇到卡爾·蔡司，并共同創(chuàng)立了所謂的“蔡司光學工程”，現(xiàn)在被稱為蔡司。此外，他還于1884年共同創(chuàng)立了Schott Glassworks。阿貝也是*個定義術(shù)語數(shù)值孔徑的人。1873年，阿貝出版了他的理論和公式，解釋了顯微鏡的衍射極限。阿貝認識到標本圖像由多個重疊的多重強度的衍射極限點（或艾里版）組成。
為了提高分辨率（d =λ/ 2 NA），必須使用較短波長（λ）光或通過具有較高折射率的成像介質(zhì)或具有高NA的光學部件（或，實際上是所有這些因素的組合）。
然而，即使考慮到所有這些因素，由于整個系統(tǒng)的復雜性，波長在400nm以下的玻璃的傳輸特性以及在完整的波長下達到高的NA，實際顯微鏡系統(tǒng)的限制仍然有限制顯微鏡。理想光學顯微鏡中的橫向分辨率限制在約200nm，而軸向分辨率約為500nm（例如分辨率限制，請參見下文）。
約翰·威廉·斯特拉特和“瑞利標準”（1896）
約翰·威廉·斯特魯特（John William Strutt），3rd Baron Rayleigh（1842-1919）是英國物理學家和多產(chǎn)作家。他在一生中寫了***的466篇出版物，其中包括430篇科學論文。他寫了一系列廣泛的主題，如鳥飛，心理研究，聲學等，并于1895年發(fā)現(xiàn)了氬氣（他于1904年被授予諾貝爾物理學獎）。
瑞利建立并擴大了喬治·艾里的作品，并于1896年發(fā)明了“瑞利標準”的理論。瑞利標準（圖2）定義了衍射受限系統(tǒng)中的分辨率極限，換句話說，當兩點光可以區(qū)分或相互分離。
使用艾里光盤的理論，如果來自兩個單獨的艾里版光盤的衍射圖案不重疊，則它們很容易區(qū)分，“很好地解決”，據(jù)說符合瑞利標準（圖2，左圖）。當一張艾里光盤的中心直接與另一張**的衍射圖案的*個*小值重疊時，它們可以被認為是“剛剛解決”，并且仍然可以區(qū)分為兩個獨立的光點（圖2，中間）。如果艾里光盤比這更接近，那么它們不符合瑞利標準，并且“未被解析”為兩個不同的光點（或標本圖像中的單獨細節(jié);圖2右側(cè)）。
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如何計算顯微鏡的分辨率
考慮到上述所有理論，很明顯，在計算理論分辨率極限時，需要考慮許多因素。分辨率也取決于樣本的性質(zhì)。我們來看看使用阿貝的衍射極限計算分辨率，并使用瑞利標準。
首先，應該記?。?/span>
NA = n x sin α
其中n是成像介質(zhì)的折射率，α是物鏡的角孔的一半。物鏡的*大角度孔徑約為144o。該角度的一半的正弦為0.95。如果使用折射率為1.52的油的浸沒物鏡，物鏡的*大NA將為1.45。如果使用“干式”（非浸沒）物鏡，物鏡的*大NA將為0.95（空氣的折射率為1.0）。
橫向（即XY）分辨率的阿貝衍射公式為：
d =λ/ 2 NA
其中λ是用于成像樣品的光的波長。如果使用514nm的綠光和NA為1.45的油浸物鏡，則分辨率的（理論）極限將為177nm。
軸向（即Z）分辨率的阿貝衍射公式為：
d = 2λ/ NA2
再次，如果我們假設(shè)波長為514nm，以NA值為1.45的物鏡觀察樣品，則軸向分辨率將為488nm。
瑞利標準是基于阿貝的衍射極限的一個略微改進的公式：
R =1.22λ/ NAobj + NAcond
其中λ是用于成像樣品的光的波長。NAobj是物鏡的NA。NAcond是聚光鏡的NA?！?.22”的數(shù)字是一個常數(shù)。這是從瑞利關(guān)于貝塞爾功能的工作得出的。這些用于計算諸如波傳播的系統(tǒng)中的問題。
考慮到聚光鏡的NA，空氣（折射率為1.0）通常是聚光鏡和載玻片之間的成像介質(zhì)。假設(shè)聚光鏡的角度孔徑為144°，則NAcond值將等于0.95。
如果使用514nm的綠光，NA為1.45的油浸物鏡，NA為0.95的聚光鏡，則（理論）分辨率極限為261nm。
如上所述，用于對樣本進行成像的光的波長越短，則將更多的細節(jié)被解決。因此，如果使用400nm光的*短可見波長，使用NA為1.45的油浸物鏡和NA為0.95的聚光鏡，則R將等于203nm。
為了在顯微鏡系統(tǒng)中實現(xiàn)*大（理論）分辨率，每個光學部件應該具有*高的NA可用（考慮角度孔徑）。此外，使用較短波長的光來觀察樣品會增加分辨率。*后，整個顯微鏡系統(tǒng)應該正確對齊。