徠卡顯微鏡相差的原理

相差對(duì)比是一種光學(xué)對(duì)比技術(shù)，用于在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)的未染色相位物體（例如扁平細(xì)胞）。使用相差顯微鏡，可以在高對(duì)比度和豐富的細(xì)節(jié)中觀察明亮度不顯眼和透明的細(xì)胞。

使用相移圖像形成

相位物體會(huì)導(dǎo)致通過(guò)樣本的光的相移。因?yàn)橹挥蟹绕疲◤?qiáng)度的差異）對(duì)于人眼或光電檢測(cè)器是可見(jiàn)的，所以樣本的染色將介導(dǎo)振幅偏移和通過(guò)的光的強(qiáng)度差。然而，許多染色試劑對(duì)活細(xì)胞是有毒的。相差顯微鏡提供了使用由光程長(zhǎng)度差異引起的相移，使樣本在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)的可能性。它通過(guò)產(chǎn)生的光波的干擾將相移改變?yōu)榉绕啤?/span>

相差顯微鏡的技術(shù)是在20世紀(jì)30年代由荷蘭物理學(xué)家Frits Zernike開(kāi)發(fā)的。該技術(shù)在1942年投入使用后，Zernike于1953年被授予諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。

使用相移圖像形成

相位物體會(huì)導(dǎo)致通過(guò)樣本的光的相移。因?yàn)橹挥蟹绕疲◤?qiáng)度的差異）對(duì)于人眼或光電檢測(cè)器是可見(jiàn)的，所以樣本的染色將介導(dǎo)振幅偏移和通過(guò)的光的強(qiáng)度差。然而，許多染色試劑對(duì)活細(xì)胞是有毒的。相差顯微鏡提供了使用由光程長(zhǎng)度差異引起的相移，使樣本在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)的可能性。它通過(guò)產(chǎn)生的光波的干擾將相移改變?yōu)榉绕啤?/span>

相位顯微鏡的技術(shù)是在20世紀(jì)30年代由荷蘭物理學(xué)家Frits Zernike開(kāi)發(fā)的。該技術(shù)在1942年投入使用后，Zernike于1953年被授予諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。

圖1a：MDCK細(xì)胞，相差顯微鏡              圖1b：MDCK細(xì)胞，明場(chǎng)顯微鏡

圖1c：變形蟲(chóng)變形菌，相差顯微鏡           圖1d：變形蟲(chóng)變形桿菌，明場(chǎng)顯微鏡

光波的干擾

光路長(zhǎng)度是光路中兩點(diǎn)之間的折射率和厚度的乘積。它與運(yùn)輸時(shí)間和光速有關(guān)。光路長(zhǎng)度的差異導(dǎo)致光波穿過(guò)樣本時(shí)的不同速度（即相移）。結(jié)果發(fā)生相位差異。與周圍介質(zhì)相比，較高的折射率導(dǎo)致光波的減速和相位的延遲。

干擾描述了兩個(gè)波彼此的相互作用以及根據(jù)疊加原理形成的新波形。光波干涉的相關(guān)參數(shù)為光波幅值。如果兩個(gè)波浪干擾，則所得到的光波的幅度將等于兩個(gè)干擾波幅度的矢量和。

如果所得到的波的幅度增加，則干擾將被描述為具有建設(shè)性的。如果兩個(gè)波峰或兩個(gè)波谷在同一時(shí)間點(diǎn)相遇，則將是這種情況。另一波的波峰和另一波的波峰也可能在同一時(shí)間點(diǎn)相遇。這導(dǎo)致所得到的波的幅度減小。這兩個(gè)波浪之間的干擾稱為破壞性的。

相位差顯微鏡中的光路

相差顯微鏡的關(guān)鍵要素是環(huán)形孔和相位板。環(huán)形孔被放置在聚光鏡的前焦平面上，并限制穿透光波的角度。相位板位于物鏡的后焦平面上，并具有由通過(guò)它的光調(diào)光并使其相位改變?chǔ)? 4的材料制成的相環(huán)。λ表示光的波長(zhǎng)。

在相位顯微鏡下，在K?hler照明條件下，不與樣品相互作用的光波作為物鏡的后焦平面上的亮環(huán)聚焦。光環(huán)在光軸上與相位環(huán)空間匹配，導(dǎo)致未透光的相移。被樣品衍射的光不會(huì)主要撞擊相環(huán)，因此不受影響。

在受影響和未受影響的光波之間，總相移高達(dá)λ/ 2。未衰變光的相位在相位上提前λ/ 4，衍射光波通常被生物樣本延遲λ/ 4。λ/ 2的總相移允許光波在圖像平面中的破壞性干擾。為了減弱通過(guò)相環(huán)的未透光，重要的是避免與偏斜光相比未發(fā)光的外顯。

如相位顯微鏡觀察到的，λ/ 2的相移產(chǎn)生*大的相消干涉效應(yīng)，因?yàn)椴ǚ搴筒墼谕粫r(shí)間點(diǎn)有效地達(dá)到。因此，光波的幅度減小，相位對(duì)象的相移被變換為振幅。

圖2：相差顯微鏡中的光路。通過(guò)聚光鏡環(huán)的環(huán)形光通過(guò)聚光鏡聚焦在樣品上。環(huán)形光的一部分由樣品（例如質(zhì)膜，細(xì)胞器等）的光密度結(jié)構(gòu)衍射，經(jīng)歷大約1/4λ的相移（通常用于生物樣本）。該相移并且衍射光繞過(guò)相環(huán)，并且?guī)缀醪皇芟喹h(huán)（主要位于物鏡的后焦平面）的影響。相比之下，來(lái)自聚光鏡環(huán)的直接環(huán)形光將撞擊相環(huán)，這將使直射光變暗，并引起相移（通常前進(jìn)為1/4或延遲?λ為正相位對(duì)比）。由于由樣品折射的光與通過(guò)相位的光之間的總相移將達(dá)到1/2λ，將會(huì)發(fā)生相消干涉。光密度結(jié)構(gòu)將因此顯得較暗（呈正相位對(duì)比）。

正負(fù)兩種形式的相位對(duì)比

相位對(duì)比有兩種形式：正負(fù)相位對(duì)比度。它們主要不同于用于照明的相位板。在正相位對(duì)比中，通過(guò)相位的光的相位與偏離光相比是前進(jìn)的，而在相位相位上則呈相位延遲。負(fù)相位對(duì)比度的相位延遲導(dǎo)致相位差的破壞。光波同相，而不是破壞性干擾，會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)大的干擾。這導(dǎo)致所得到的光波的幅度增加。  

在正相位顯微鏡中，具有比周圍介質(zhì)更高的折射率的物體顯示為比具有較低折射率的物體更暗。對(duì)于負(fù)相位對(duì)比度則相反。

解釋相位圖像

相差顯微鏡顯示樣本的光程長(zhǎng)度差異。光路長(zhǎng)度與樣品的厚度和折射率有關(guān)。細(xì)胞結(jié)構(gòu)如質(zhì)膜和細(xì)胞器對(duì)光程長(zhǎng)度有深遠(yuǎn)的影響。許多細(xì)胞（特別是在細(xì)胞培養(yǎng)物中）具有平坦和規(guī)則的形狀，它們?cè)诿鲌?chǎng)顯微術(shù)中幾乎看不到。

這種細(xì)胞的相差圖像放大細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異，并且可以被認(rèn)為是光密度圖，因?yàn)楣饷芏葘?duì)樣品或材料的折射率有很大的影響。然而，由于不直接依賴于光路長(zhǎng)度的差異，因此幾種效應(yīng)會(huì)使相位對(duì)比圖像的正確解釋復(fù)雜化。

光環(huán)效應(yīng)描述了正相位對(duì)比度的明亮邊緣的外觀或大對(duì)象周圍的負(fù)相位差的暗邊緣。由于來(lái)自試樣的一些衍射光也穿過(guò)相位環(huán)，所以形成光暈。由未形成的波形成的光環(huán)比相位稍微小一點(diǎn)，并且來(lái)自試樣的低空間頻率衍射光波可以通過(guò)環(huán)帶。通過(guò)相位的偏斜光保持90°的相位差，因此不受破壞性干擾的影響。這導(dǎo)致對(duì)比度的逆轉(zhuǎn)，并導(dǎo)致大對(duì)象邊界處的光環(huán)。

遮光效果描述了以與周圍介質(zhì)相同的光強(qiáng)度顯示樣品的均勻部分的情況。盡管通過(guò)這些區(qū)域的光經(jīng)歷相移，但僅發(fā)生少量衍射，并且散射角大大降低。因此，這些光波如未亮化的光進(jìn)入相環(huán)，不會(huì)受到干擾。

相差顯微鏡中的另一個(gè)問(wèn)題可以是對(duì)比反演。如果折射率較低的物體與折射率較低的物體相鄰，則它們將顯得更亮，而不是較暗（對(duì)于正相位差）。在這樣的區(qū)域中，相移不是生物樣本的λ/ 4的通常偏移，而不是破壞性干擾，發(fā)生建設(shè)性干擾（與負(fù)相位相反）。

雖然這些效應(yīng)可以使相位對(duì)比圖像的解釋變得困難，但相位顯微鏡是成像相位物體的一種方便和重要的光學(xué)對(duì)比度技術(shù)。此外，相差顯微鏡可以調(diào)查活體標(biāo)本中的細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)，使其成為生物研究中*常用的對(duì)比方法。

圖4a：曲霉菌，相差顯微鏡         圖4b：大鼠睪丸，相差顯微鏡      圖4c：菜豆，相差顯微鏡