奧林巴斯顯微鏡配置故障診斷和其他常見錯誤
奧林巴斯顯微鏡配置故障診斷和其他常見錯誤
像任何形式的攝影一樣，顯微攝影可以容易地出現(xiàn)各種故障和錯誤，無論顯微鏡設(shè)備的復(fù)雜程度如何，或是顯微相機的經(jīng)驗水平和技能。錯誤必須仔細檢查以確定來源，這通常是由于設(shè)備故障，樣品準(zhǔn)備不良，技術(shù)不當(dāng)或處理錯誤導(dǎo)致的。
大多數(shù)顯微照相誤差可以追溯到顯微鏡的光學(xué)配置，包括不正確調(diào)整的照明，錯誤的過濾器的使用，或聚光鏡和/或場孔光闌的錯誤設(shè)置。下一個*常見的問題是由于標(biāo)本制備不良和樣品或顯微鏡光學(xué)元件上的污垢，灰塵或污染油引起。圖1顯示了小麥銹病膿皰（由*小菜蛾感染引起的）的顯微照片，其顯示了幾種常見的顯微照相差錯。該圖的中心部分（包圍在一個白色的圓圈中）不對焦，左上角和右上角顯示來自場隔膜和漸暈的陰影。使用黑色的顯微照片中的對比度誤差 白色膜在圖1的左下部分中表示為在顯微照片中導(dǎo)致太多圖像對比度的對比度濾光片選擇不佳的區(qū)域。在圖1的右側(cè)的白色圓圈中示出了焦點問題，并且由于物鏡前透鏡上的振動，球面像差和污染油引起的樣本細節(jié)和對比度的缺乏。還包括在顯微照片中的是膜損傷誤差粉塵污染。這些和其他類似的錯誤，例如使用過于嚴重染色或過厚的標(biāo)本，代表了在常規(guī)顯微照相術(shù)下面臨的*常見的顯微鏡錯誤。以下段落涉及顯微照相中的具體錯誤和故障，并提出建議的補救措施。球面像差和物鏡前透鏡上的污染油在圖1右側(cè)的白色圓圈中示出。顯微照片中還包括膜損壞誤差和灰塵污染。這些和其他類似的錯誤，例如使用過于嚴重染色或過厚的標(biāo)本，代表了在常規(guī)顯微照相術(shù)下面臨的*常見的顯微鏡錯誤。以下段落涉及顯微照相中的具體錯誤和故障，并提出建議的補救措施。球面像差和物鏡前透鏡上的污染油在圖1右側(cè)的白色圓圈中示出。顯微照片中還包括膜損壞誤差和灰塵污染。這些和其他類似的錯誤，例如使用過于嚴重染色或過厚的標(biāo)本，代表了在常規(guī)顯微照相術(shù)下面臨的*常見的顯微鏡錯誤。以下段落涉及顯微照相中的具體錯誤和故障，并提出建議的補救措施。例如使用過度染色或過厚的標(biāo)本，代表了在常規(guī)顯微照相術(shù)下面對顯微鏡的*常見的錯誤。以下段落涉及顯微照相中的具體錯誤和故障，并提出建議的補救措施。例如使用過度染色或過厚的標(biāo)本，代表了在常規(guī)顯微照相術(shù)下面對顯微鏡的*常見的錯誤。以下段落涉及顯微照相中的具體錯誤和故障，并提出建議的補救措施。
圖片失焦，模糊或銳化的 - 缺乏適當(dāng)?shù)慕裹c和/或模糊圖像代表了顯微照相中*常見的錯誤之一。這些誤差的來源通常是顯微鏡支架的振動或光學(xué)元件與薄膜平面之間焦距的不正確調(diào)整。通常，圖像將通過目鏡以尖銳的焦點出現(xiàn)，但所得的顯微照片模糊或不清晰（圖2（a））。這表明膠片平面和觀察光學(xué)元件可能不是parfocal。在裝有聚焦望遠鏡的顯微鏡中，檢查標(biāo)線上的十字線以確保它們處于尖銳的焦點。仔細調(diào)整目鏡掩模版（如果配備好）與聚焦望遠鏡之間的對焦，以使兩個光罩同時對焦。如果目鏡顯示對焦的樣品，但是目鏡中的標(biāo)線沒有聚焦，則樣品圖像將在膠片上看起來不清晰，反之亦然。
焦距偏差通常以低功率（1倍-4倍）的物鏡出現(xiàn)，其中膠片平面的焦點深度非常淺，并且顯微鏡對焦旋鈕的微小誤差導(dǎo)致不清晰的圖像（見圖2（a））。目鏡和聚焦望遠鏡中的光罩應(yīng)該是尖銳的焦點，并且眼睛之間的瞳孔之間的距離應(yīng)該被適當(dāng)?shù)乇３帧Ｊ褂玫捅堵饰镧R（10x），使用具有尖銳邊緣定義的臺式千分尺或樣品，仔細地將樣品對準(zhǔn)目鏡。接下來，調(diào)整聚焦望遠鏡中的掩模版，直到圖像處于銳焦?fàn)顟B(tài)，確保當(dāng)疊加在空中圖像上時，該掩模版中的薄十字線也被聚焦和不同。許多制造商提供售后市集重點援助，這是一個簡單的可調(diào)節(jié)放大鏡，可用于查看聚焦望遠鏡分劃板以輔助對焦調(diào)整。調(diào)整兩個目鏡，使它們彼此對焦和聚焦望遠鏡。還要檢查投影鏡頭或光電管目鏡，確保其牢固就位。
當(dāng)將標(biāo)準(zhǔn)的單反相機用于顯微照相時，圖像必須通過相機對焦取景器（通常是玻璃幕）進行聚焦。在低放大率下，屏幕不存在問題，但是如果研磨玻璃的表面太粗糙，則在較高放大倍率下聚焦變得困難。如果出現(xiàn)此問題，請切換到具有清晰中心的聚焦屏幕，用于圖像的關(guān)鍵焦點，或者通過將小蓋玻片固定在玻璃屏幕表面上來修改大幅面相機的聚焦屏幕（如John Delly在其書中所提到的那樣）“ 通過顯微鏡攝影 ”）使用加拿大香脂作為粘合劑。所產(chǎn)生的組合在屏幕覆蓋的屏幕區(qū)域中提供透明中心。Delly還建議在固定在蓋玻片上之前，使用軟鉛筆或印度墨水在玻璃表面上繪制十字或兩個對角線。該程序為視差聚焦提供了一套“十字線”。
在圖2中示出了幾個顯微鏡照片，其顯示了顯微鏡焦點的錯誤（圖2（a））和由于振動引起的鈍化圖像（圖2（c））。標(biāo)本是一種薄薄的Tilia（椴木）莖，用專門為植物組織設(shè)計的四重混合物染色。圖2（a）描繪了由于由上述誤差引起的光學(xué)器件和膜平面之間的焦距的不正確調(diào)整而不對焦的典型顯微照相。右圖（圖2（c））是相同視場的顯微照片，但受到嚴重振動的影響，導(dǎo)致圖像銳度的損失。圖2（b）中的顯微照片說明了尖銳焦點的Tilia染色薄片。
散光和必須戴眼鏡的顯微鏡學(xué)家即使通過目鏡出現(xiàn)焦點，也可能難以產(chǎn)生清晰的圖像。佩戴眼鏡時通過聚焦望遠鏡調(diào)整樣本焦點往往特別困難。治療方法是使用一組高眼點目鏡或聚焦望遠鏡來糾正問題。請與顯微鏡制造商聯(lián)系確定這些附件是否可用。
當(dāng)樣品制備太厚或顯微鏡載玻片無意中被顛倒檢查時，聚焦也可能是一個問題（圖3（a））。通常可以通過使用長工作距離物鏡來克服厚度誤差，但*佳的解決方案是使用較薄的部分重新制作樣品，或者在制劑上更緊密地擠壓蓋玻片。倒置顯微鏡載玻片的簡單固定裝置是將其翻轉(zhuǎn)，因此蓋玻璃面對物鏡（圖3（a）和3（b））。偶爾，在樣品制備期間，幾個蓋玻片將粘在一起，并且所得的顯微鏡載片將具有兩個或更多個蓋玻片，導(dǎo)致所得顯微照片中的球面像差問題。如果懷疑這個錯誤，仔細檢查包含蓋玻片的顯微鏡載玻片是否存在干涉條紋，這將由于兩個蓋玻片之間的殘留空間而發(fā)生。使用一對鑷子強制*上面的蓋玻片。
在高放大倍數(shù)干物鏡上校正套環(huán)的不正確調(diào)整或使用具有高數(shù)值孔徑的高干燥物鏡與錯配的蓋玻片（蓋玻片）通常是不清晰的顯微照片的原因（圖3（c））。當(dāng)顯微鏡蓋玻片太厚或太薄時，這些誤差是由球面像差的欠矯或過矯矯引起的。在這種情況下，不可能精確地對準(zhǔn)顯微鏡并獲得清晰的圖像。蓋玻片厚度問題的解決方案是用一個正確的厚度（通常是1?蓋玻璃，其平均值為0.17毫米厚，標(biāo)準(zhǔn)變化在0.16和0.19毫米之間）替換不合適的蓋玻片，或者使用配備校正領(lǐng)可以調(diào)整以匹配蓋玻片的厚度。如果蓋玻片厚度不能調(diào)整（即粘貼在標(biāo)本滑塊上），或者如果厚度未知，并且沒有使用矯正套環(huán)的物鏡，則有時可以通過使用可比較的油浸物鏡來解決問題放大。因為浸油的折射率與蓋玻片的折射率非常相似，所以厚度變化不那么重要。
圖3所示的顯微照片顯示球面像差誤差的影響。標(biāo)本是感染有枯萎病菌的馬鈴薯（Solanum tuberosum）組織的染色薄片。圖3（a）示出了反轉(zhuǎn)（倒置）顯微鏡載玻片的效果，其導(dǎo)致由于球面像差導(dǎo)致的圖像中的對比度和清晰度的損失。同樣，圖3（c）示出了在高數(shù)值孔徑和高放大率物鏡上校正套環(huán)的不正確調(diào)整。該樣品的蓋玻片厚度為0.17毫米，但校正套環(huán)的厚度為0.23毫米。圖3（b）顯示了當(dāng)蓋玻片厚度優(yōu)化并且顯微鏡被適當(dāng)調(diào)整時，顯微照片應(yīng)該如何出現(xiàn)。
不清晰圖像的另一個原因是物鏡前透鏡，照片目鏡（投影透鏡）的頂部鏡頭或標(biāo)本滑塊上的油（來自指紋的浸油或天然油）。存在于干燥物鏡的前透鏡上的油是當(dāng)將物鏡放置在預(yù)先潤滑的載玻片上的位置時可能發(fā)生的常見事故。如果立體顯微鏡可用，請取下物鏡和/或照片目鏡，并以高倍率仔細檢查。使用這種技術(shù)，在前鏡上經(jīng)常會看到油污。從顯微鏡鏡頭去除油可能是困難的，并且經(jīng)常導(dǎo)致用新的灰塵和碎屑代替存在于鏡片上的舊灰塵。首先用鏡片組織輕輕地從表面清除多余的油分，清理鏡片，然后使用手術(shù)棉或高品質(zhì)鏡片紙的木制涂抹器，在用三氯乙烷，******或二甲苯濃縮后將其清潔。避免使用過多的溶劑，這可以攻擊用于將鏡頭固定到其底座上的水泥。
除去污染的油后，使用駱駝毛或貂毛刷清除鏡頭上可能存在的灰塵，污垢或碎屑?？梢酝ㄟ^將刷子浸入少量的******并將其搖晃干燥來脫脂。氣球或橡膠耳塞注射器通?？捎糜诖得撏哥R上的松散灰塵，但不要使用罐裝空氣，因為它可能會留下比浸油更難除去的殘留物。污染浸漬油*常發(fā)生在設(shè)計用于浸漬介質(zhì)的物鏡上，但是當(dāng)使用浸沒物鏡觀察殘留油的蓋玻片的頂部擺動時，干燥物體也可能被污染。當(dāng)遇到焦點錯誤或者具有這些物鏡的不清晰圖像時，請始終檢查干燥物鏡的前置鏡頭是否有污染。
在許多較老的顯微鏡中，物鏡與目鏡特別匹配，以便校正*終圖像中的光學(xué)像差。不清楚的圖像也可能由顯微鏡主體管和物鏡之間的管長度機械尺寸不匹配引起。用于固定管長度顯微鏡的大多數(shù)物鏡是設(shè)計為管長為160毫米，但這并不是不變的，并且使用管長不匹配的物鏡會導(dǎo)致球面像差的引入，從而降低圖像清晰度。管子長度要求通?？淘谖镧R筒上，因此檢查該值以確保在使用前與顯微鏡兼容。具有無窮遠光學(xué)校正的物鏡旨在用于配備有管透鏡的顯微鏡，并且不適合用于較老的標(biāo)準(zhǔn)固定管長度顯微鏡。同樣，為固定管長度顯微鏡設(shè)計的物鏡不應(yīng)與無窮遠校正顯微鏡一起使用。
圖4說明了使用浸油時通常發(fā)生的幾個錯誤。標(biāo)本是苜蓿植物組織的多重染色薄片，已經(jīng)被疣狀*（Physoderma alfalfae）感染。左側(cè)的顯微照片（圖4（a））顯示了當(dāng)氣泡已被捕獲在顯微鏡蓋玻片和物鏡前透鏡之間時，通過高倍率（60x）油浸物鏡形成的圖像。在這些條件下，所產(chǎn)生的圖像是模糊的并且不清晰，并且遭受對比度的顯著損失。如果目鏡被取下，則可以在物鏡的后焦平面清晰地看到油泡。當(dāng)油物鏡通常具有稍微凹入的前透鏡時，通常會發(fā)生該誤差，被放置在已經(jīng)放置在蓋玻片的頂表面上的油池中。物鏡不應(yīng)該降低到浸油中。相反，*好的做法是通過旋轉(zhuǎn)鼻梁以“滑動”物體到油面上方的滑動動作，以避免在蓋玻片和物鏡前透鏡之間捕獲空氣。圖4（c）示出了在類似條件下拍攝的顯微照片，但具有干燥的60倍物鏡。所得到的圖像的焦點更好，并且具有比圖4（a）所示的更大的對比度。在這種情況下，圖像劣化是由于物體前透鏡上的油污染。當(dāng)顯微鏡蓋玻片上的油墨池中意外地擺動物鏡時，在油墨顯微鏡目鏡下方放置的干物體容易被油污染。圖4（b）中的圖像沒有錯誤，代表感染的苜蓿組織，因為它應(yīng)該出現(xiàn)。
通常由振動引起間歇性聚焦誤差，通常在長時間曝光時使用高放大倍數(shù)時可以看到。使用可用的*高放大倍數(shù)物鏡將顯微鏡對準(zhǔn)鋒利的標(biāo)本，以測試振動問題。連續(xù)振動通常會使樣品出現(xiàn)運動。來自桌面的振動或來自空氣處理單元和風(fēng)扇的風(fēng)流將導(dǎo)致顯微鏡緩慢失焦。允許顯微鏡在聚焦在樣品上時保持靜止，并測量振動使顯微鏡脫離焦點所需的時間。如果立即發(fā)生焦距下降，則需要進行某種形式的隔振。然而，如果顯微鏡將在高放大倍數(shù)下保持對焦幾分鐘或更長時間，
可以通過使用非常快的快門速度來部分克服連續(xù)振動誤差的影響，通常為一到幾百分之一秒。也可以使用電子閃光燈組件以更快的快門速度來增加照明，以克服顯微照相中的振動誤差。然而，這種補救措施只能*小化振動偽像的影響，并且不會消除原因。在振動問題很重要的情況下，顯微鏡應(yīng)安裝在適合振動隔離的合適的減震器上。幾個顯微鏡制造商和一些售后供應(yīng)商提供振動“墊”（通常由氯丁橡膠，硅膠或類似的聚合物制成），可以放置在顯微鏡底墊下。
舞臺漂移是當(dāng)舞臺的重量引起顯微鏡對焦架移動時降低舞臺（和樣本）并導(dǎo)致顯微鏡失焦的問題。在許多現(xiàn)代顯微鏡中，包括一個聚焦架張緊機構(gòu)來消除或減少漂移。經(jīng)歷此問題的較舊的顯微鏡可能會有磨損或松動的對焦架，并應(yīng)由專業(yè)維修技術(shù)人員進行維修。
一些振動問題是由相機附件中的機械快門動作造成的。如果振動問題持續(xù)存在，請始終使用具有機械快門的照相機的電纜釋放裝置，并增加曝光時間*過一秒的中性密度濾光片。較長的曝光時間將*小化快門振動的影響，這僅在曝光的初始部分發(fā)生。
對比度錯誤和圖像分辨率差 - 差的對比度通常表明分層聚光鏡孔徑光闌打開得太寬，引起閃光并顯著降低圖像對比度。這個問題困擾著所有類型的顯微照相，包括彩色，黑白和數(shù)字。為了糾正這個問題，請移除其中一個目鏡，將相位望遠鏡插入眼管，或者（如果顯微鏡配備好的話）將Bertrand鏡頭擺放到光路中。在觀察物鏡的后焦平面時，調(diào)整聚光鏡孔徑光闌，直到其直徑介于物鏡孔徑的65％至80％之間（以實現(xiàn)適當(dāng)?shù)?strong>K?hler照明并*大化圖像對比度）。當(dāng)使用反射光顯微鏡時，
如上所述，利用具有不正確厚度的蓋玻片的高數(shù)值孔徑物鏡也可能導(dǎo)致由于球面像差引起的對比度（和缺少圖像清晰度）的損失。檢查物鏡鏡筒是否符合蓋玻片厚度，或切換到具有蓋玻片厚度校正環(huán)的物鏡。在不使用蓋玻片的情況下，對于觀察和顯微照相校正反射光物鏡，因此避免具有這種目的的蓋玻片。
樣本本身可能是對比問題的根源。當(dāng)使用對比度增強技術(shù)之一，如相差，霍夫曼或微分干涉，透明和未染色的樣本難以使用明場照明進行成像并產(chǎn)生更好的顯微照片。傾斜照明也將改善未染色標(biāo)本中的對比度。
當(dāng)在黑白顯微攝影中使用對比度濾鏡時，差的濾光片選擇通常會導(dǎo)致在所得的顯微照片中缺少樣本對比度。正確使用對比過濾器將確保在使用染色標(biāo)本時更好地再現(xiàn)樣品細節(jié)，但只有當(dāng)過濾器的顏色與樣品的顏色互補時才能使用。當(dāng)與染色樣本相同顏色的光透過樣品時，結(jié)果是樣品與背景之間的對比度降低。當(dāng)使用在樣品吸收可見光的區(qū)域中具有*小或僅部分吸收的過濾器時，獲得*佳結(jié)果。對比度也可以在黑色＆
在圖5中給出了顯微照相中的幾個對比度誤差，其示出了多重染色馬鈴薯（Solanum tuberosum）組織薄切片的一系列明場圖像。用Fujichrome 64T拍攝左邊的顯微照片（圖5（a）），一種鎢平衡的透明膠片，當(dāng)正確加工時通常顯示出顯著的對比度。在這種情況下，由于不正確的處理和/或聚光鏡孔徑光闌打開得太寬，圖像缺乏對比度。圖5（c）示出了采用相同領(lǐng)域的黑白顯微照片，但是使用對比度過濾器并用高對比度顯影劑處理。圖5（c）中的對比度過大是由于用于增加黑色＆白色顯微照相。代替使用在可見光譜的綠色區(qū)域中具有部分吸收的濾光器（以產(chǎn)生紅色泡囊中的對比度），選擇Kodak Wratten 25號紅色濾光器用于曝光，然后在顯影劑中錯誤地處理該膜在產(chǎn)生過大對比度的條件下。中央顯微照片（圖5（b））說明了應(yīng)該出現(xiàn)的馬鈴薯薄片部分。
當(dāng)成像太厚的樣本制劑時，也會發(fā)生差的對比度，如上所述。這種情況可以通過仔細的樣品制備來克服，使用較薄的樣品，蓋玻片牢固地定位并用透明粘合劑（如加拿大香脂）固定。
雖然彩色膠片的問題較少，但是黑白顯微照相術(shù)中常見的是對比度過大。如上所述，主要原因是對具有染色標(biāo)本的對比過濾器的選擇不正確，但是電影處理錯誤也應(yīng)該是可疑的。當(dāng)使用柯達技術(shù)盤等高對比度膠片時，膠片顯影劑的選擇應(yīng)與用于拍攝圖像的濾鏡組合重合。如果選擇設(shè)計用于減少樣本對比度的對比度濾鏡，則顯影劑也應(yīng)在黑白底片上產(chǎn)生低對比度圖像。相反，當(dāng)使用對比度過濾器來提高樣本對比度時，選擇高對比度顯影劑來幫助在*終圖像中產(chǎn)生正確的對比度。使用具有正常膠片的高對比度顯影劑通常會導(dǎo)致圖像具有過大的對比度，延長開發(fā)時間。由于電影和黑白電影發(fā)展商的選擇范圍廣泛，因此應(yīng)仔細注意開發(fā)過程，以微調(diào)所得顯微照片中的對比度。
顯微攝影中的分辨率差，通常是由于分層聚光鏡孔徑光闌的調(diào)整不當(dāng)造成的。當(dāng)顯微鏡正確配置為柯勒照明時，孔徑光闌應(yīng)具有位于物鏡孔徑的65％和80％之間的光圈直徑開口。如果隔膜打開得太遠，則會產(chǎn)生較差的圖像對比度（圖6（a）），并且顯微照相會損失可見度。如果隔膜開口減小到小于物鏡孔徑的50％的直徑，則分辨率顯著降低，并且在顯微照片中衍射偽影變得明顯。當(dāng)孔徑光闌開口減小到*小尺寸時，發(fā)生嚴重的圖像劣化，并且顯微照片變得暗并且被衍射偽影遮蔽，主要是圍繞細結(jié)構(gòu)細節(jié)的邊緣的暗光暈。當(dāng)分層聚光鏡在顯微鏡載物臺下方太低時，會發(fā)生類似的情況。這兩個誤差都是由聚光鏡產(chǎn)生的照明錐體的尺寸和質(zhì)量降低的結(jié)果，這不允許物鏡在其全數(shù)值孔徑下操作。
顯微照相中的常見分辨率誤差如圖6所示，其顯示了感染黑結(jié)的梅花樹干組織染色薄片的一系列顯微照片，該黑色結(jié)是由*Apiosporina morbosa（也稱為Dibotryon morbosum）引起的梅樹的破壞性疾病。選擇性地對梅樹組織切片進行彩色染色，以顯示細節(jié)細節(jié)，區(qū)分亞細胞成分進行觀察。在該圖中，使用具有40x平面物鏡（NA = 0.75）和擺放頂部透鏡消色差聚光鏡（NA = 0.90 ）的Fujichrome 64T透明膜顯示聚光鏡孔徑光闌打開設(shè)置對通過顯微照相拍攝的圖像質(zhì)量的影響。）。大致的聚光鏡孔徑開口尺寸為：圖6（a） - 95％（NA = 0.81）; 圖6（b） - 60％（NA = 0.54）; 圖6（c）-20％（NA = 0.18）。
在圖6（a）中，其中孔徑光闌設(shè)置在聚光鏡和物鏡的數(shù)值孔徑幾乎相等的位置，很大程度上可以看到精細的樣品細節(jié)，盡管仍然存在大量的散射和眩光，整體圖像對比度受到嚴重影響。該圖像也比其對應(yīng)部分明顯更亮，這是通過孔徑光闌的較小設(shè)置進行的。圖6（b）示出了在聚光器孔徑尺寸下產(chǎn)生約70％物鏡數(shù)值孔徑的梅花桿。眩光減少，圖像非常清晰，并且精細的圖像細節(jié)存在而沒有顯著的衍射偽像。對于該樣品，圖6（b）中的顯微照片代表了聚光鏡孔徑光闌的*佳設(shè)置。當(dāng)光闌在物鏡數(shù)值孔徑的約25％處閉合到*小的設(shè)置（圖6（c））時，精細的圖像細節(jié)會被衍射偽影遮蔽。圖像也呈現(xiàn)較暗的整體投射，產(chǎn)生樣本色調(diào)的變化。
從上述討論可以看出，聚光鏡孔徑光闌應(yīng)該被設(shè)置在將提供在很大程度上取決于樣品的吸收，衍射和折射特性的直接和偏離光的折中混合的位置。必須完成這項工作，而不會使圖像淹沒在模糊細節(jié)的偽影中，并提供對比度的錯誤增強。產(chǎn)生*佳顯微照片所需的圖像細節(jié)和對比度的量也取決于折射率，光學(xué)特性和其他樣品相關(guān)參數(shù)。當(dāng)使用對比度增強技術(shù)時，顯微鏡的正確對準(zhǔn)和配置對于確保在這些特殊條件下準(zhǔn)確地再現(xiàn)樣品細節(jié)是重要的。
當(dāng)孔徑光闌被錯誤地閉合太遠時，偏斜的光開始模糊直接照射光線，導(dǎo)致在顯微照片中引起可見邊緣，條紋和/或圖案形成的衍射偽像。其他問題，如折射現(xiàn)象，也可能在不真實的圖像中產(chǎn)生明顯的結(jié)構(gòu)?；蛘撸蜷_聚光鏡孔太寬會導(dǎo)致顯微鏡內(nèi)的樣品和光學(xué)表面的不必要的眩光和光散射。這導(dǎo)致對比度的顯著損失和圖像細節(jié)的清洗。正確的設(shè)置將因樣品而異，并且經(jīng)驗豐富的顯微鏡將很快學(xué)會通過觀察圖像來準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)聚光鏡孔徑光闌（和系統(tǒng)的數(shù)值孔徑），而不必在物鏡的后焦平面上觀察膈肌。事實上，許多顯微學(xué)家認為，顯微鏡系統(tǒng)的數(shù)值孔徑的關(guān)鍵減少以優(yōu)化圖像質(zhì)量是顯微照相中*重要的一個步驟。
照明錯誤 - 建立適當(dāng)?shù)目评照彰鞯臈l件可能是關(guān)鍵顯微照相顯微鏡配置的*重要方面。當(dāng)光源未正確定位和/或物鏡和分層聚光鏡相對于彼此或與顯微鏡光軸在中心對準(zhǔn)時，照明錯誤*為頻繁。在通過目鏡觀察樣品時，這些部件的輕微錯位可能不明顯，但誤差將在所得的顯微照片中產(chǎn)生強度梯度。結(jié)果將是一個顯微照片，顯示標(biāo)本圖像的一側(cè)或背景比另一側(cè)更暗的不均勻照明。
當(dāng)顯微照片顯示照明錯誤的證據(jù)時，首先檢查燈絲對準(zhǔn)，燈泡反射鏡位置和位于燈箱和顯微鏡底座之間的擴散屏幕。丟失的擴散屏幕將導(dǎo)致燈絲的圖像投影到標(biāo)本圖像共軛平面，并可能導(dǎo)致明亮的斑點，黑點和不均勻的照明。如果擴散屏幕正確定位，請檢查燈泡燈絲對準(zhǔn)（在嘗試檢查燈絲對準(zhǔn)之前，請記住從光學(xué)路徑中移除擴散屏幕）。許多目前的顯微鏡都采用預(yù)中心鹵素?zé)艉蛢?nèi)置擴散濾光片。對于這些儀器，制造商在組裝過程中已經(jīng)實現(xiàn)了燈絲的集中。圖7示出了當(dāng)通過將一張白紙，磨砂玻璃，Kimwipe或透鏡清潔紙放置在顯微鏡端口上使燈絲看得見時，顯微鏡光端口的典型視圖。圖7（a）左側(cè)的端口包含嚴重不對準(zhǔn)的燈絲，并且不能正確定位，以便將完全填充孔徑光闌的圖像和物鏡的后焦平面聚焦。使用燈殼上的平移調(diào)節(jié)，燈絲被聚焦（圖7（b）），然后居中在光口內(nèi)（圖7（c））。圖7（a）左側(cè)的端口包含嚴重不對準(zhǔn)的燈絲，并且不能正確定位，以便將完全填充孔徑光闌的圖像和物鏡的后焦平面聚焦。使用燈殼上的平移調(diào)節(jié)，燈絲被聚焦（圖7（b）），然后居中在光口內(nèi)（圖7（c））。圖7（a）左側(cè)的端口包含嚴重不對準(zhǔn)的燈絲，并且不能正確定位，以便將完全填充孔徑光闌的圖像和物鏡的后焦平面聚焦。使用燈殼上的平移調(diào)節(jié)，燈絲被聚焦（圖7（b）），然后居中在光口內(nèi)（圖7（c））。
如果收集器鏡頭未正確聚焦，則可能會出現(xiàn)正確對準(zhǔn)燈絲的難度。具有內(nèi)置照明器的大多數(shù)顯微鏡對于在工廠預(yù)先對準(zhǔn)和聚焦的收集器鏡頭缺乏調(diào)整。在這種情況下，顯微鏡必須由經(jīng)過培訓(xùn)的技術(shù)人員進行維修。較老的顯微鏡可以對收集器鏡頭進行調(diào)整，或者可以配備具有各種調(diào)節(jié)的外部照明器。在燈絲正確對準(zhǔn)之后，將擴散屏幕更換在燈箱和顯微鏡底座之間的位置。請注意，在裝有鎢絲燈的舊顯微鏡中，燈泡內(nèi)燈絲的位置可能因燈而異。在恢復(fù)顯微照相之前，通過目視觀察，通過*廣泛的領(lǐng)域檢查顯微鏡照明，沒有樣本存在。這通過選擇可用的*低功率物鏡并在光路中放置中性密度濾光器來降低照明強度來實現(xiàn)。如果視野仍然看起來具有不均勻的照明，則子站聚光鏡的對準(zhǔn)是可疑的。
分層聚光鏡通常配有一對定心螺釘，允許顯微鏡相對于物鏡和顯微鏡的光軸使聚光鏡居中。該步驟是建立K?hler照明所必需的，但在常規(guī)使用顯微鏡時聚光鏡可能會失配。要檢查聚光鏡的位置，首先將10x物鏡旋轉(zhuǎn)到位置，并在顯微鏡平臺上放置輕微染色的樣品。接下來，通過使用位于載物臺下方的齒條機構(gòu)來升高或降低分層聚光鏡來聚焦場隔膜。膜片應(yīng)疊加在樣品的聚焦圖像上，并關(guān)閉孔徑，直到各個葉片出現(xiàn)銳焦，虹膜開口直徑約占視場的25-40％。使用位于聚光鏡殼體上的定心螺釘將現(xiàn)場光闌開口對準(zhǔn)在視場中，并打開刀片，直到其位于視場外。如果場光闌葉片掩蓋了太多的視場，則它們可能是不均勻照明的來源。
安裝在旋轉(zhuǎn)塔架中的物鏡很少是對準(zhǔn)錯誤的根源，因為它們被固定到位置。一些偏光顯微鏡具有專門的鼻梁，允許物體通過一對定心螺釘在光學(xué)通路中居中。當(dāng)耦合到旋轉(zhuǎn)360度角的預(yù)中心圓形平臺時，這些物鏡特別有用（具有圓形臺階的舊顯微鏡通常需要各個物鏡的中心）。雙折射樣品可以放置在舞臺上，并用于幫助將物鏡對準(zhǔn)光路。為了避免誤配對象的問題，請始終檢查以確保噴頭被牢固地定位在指定擋塊的范圍內(nèi)。旋轉(zhuǎn)時，噴頭應(yīng)“點擊”
在顯微照片中，圖像的外邊緣（通常稱為漸暈）逐漸變黑通常是由不正確對準(zhǔn)的分層聚光鏡引起的，或者聚光鏡未設(shè)置在顯微鏡平臺下方的適當(dāng)高度。當(dāng)聚光鏡配置不正確時，減小孔徑光闌中的開口尺寸可能導(dǎo)致場外周變暗，或在顯微照片中會暈暈（圖8（c））。漸暈的另一個原因是使用具有與膜乳液尺寸不相容的放大系數(shù)的照片目鏡，并且不能填滿整個薄膜對角線，或者具有比將圖像投影所需的更小或更長的三目光管電影飛機。作為示例，4×5英寸顯微照片的對角線為145毫米。當(dāng)使用0.63倍放大系數(shù)的投影鏡頭（通常與數(shù)碼CCD相機一起使用）時，具有21毫米場尺寸的10x目鏡將產(chǎn)生直徑為132毫米的圖像，導(dǎo)致圖像角落的漸暈。更換為1x或（更常見的）2.5x投影鏡頭分別產(chǎn)生210和525毫米的場尺寸。較高倍率的投影鏡頭將產(chǎn)生沒有暈影的圖像。
圖8所示的顯微照片具有胎豬豬齒染色薄的部分。圖8（a）顯示了當(dāng)燈絲未正確居中時的齒細部分。在這種情況下，在顯微照片中，圖像從右到左逐漸變暗。如圖8（c）所示，影像的漸暈如圖8（c）所示，其表現(xiàn)為由于不正確的分層聚光鏡高度而包圍圖像周圍的圖像區(qū)域的邊緣逐漸變暗。當(dāng)相機快門速度太快以至膠卷無法響應(yīng)（快門速度*過0.01秒）時，也會發(fā)生此錯誤。圖8（b）中的顯微照片顯示了當(dāng)顯微鏡照明配置正確時圖像應(yīng)該如何出現(xiàn)。
當(dāng)顯微照片的角落顯示暗光，虹膜光圈快門葉片的銳利聚焦圖像時，場光闌可能未充分打開，并且應(yīng)在目鏡中可見。現(xiàn)場光闌虹膜開口尺寸的適當(dāng)調(diào)整恰好在視野外，或至少在包含在顯微照片中的場區(qū)外。當(dāng)相機快門位于距離物鏡點太遠的位置時，常常會出現(xiàn)導(dǎo)致類似顯微照片（暗角）的另一個錯誤。在快門速度下，相機快門葉片的圖像可以作為剪影圖像記錄在顯微照片上，這種錯誤稱為快門陰影。雖然通常與相機系統(tǒng)相匹配的現(xiàn)代顯微鏡并不常見，安裝具有整體式鏡頭系統(tǒng)的相機時，快門陰影可能是一個問題。在后一種情況下，相機鏡頭將指示眼點位置。為了減輕問題，將中性密度濾光片放置在光路中以增加曝光時間，從而允許較慢的快門速度。
黑暗斑點和碎片 - 顯微照片中的污垢，黑點和碎片是顯微相機的常見問題的來源，可能發(fā)生在圖像焦點或電影上的模糊斑點。這種類型的污染在使用彩色膠片時可能會出現(xiàn)彩色偽像，黑色和白色膠片上會出現(xiàn)黑色或灰色斑點。如果碎屑以尖銳的焦點出現(xiàn)，那么通常是由于位于與聚焦樣品共軛的平面中的透鏡表面的污染而發(fā)生。相鄰于顯微鏡場隔膜的場透鏡和任何玻璃（通常是色平衡或校正濾光片）通常易于收集污物，并且這些部件位于主圖像共軛平面附近。場外膜片附近的污染物將會突出顯現(xiàn)在膠片上，并且放置在場隔膜附近的過濾器上的劃痕或污垢通常是霧霾和碎片偽影的來源。已經(jīng)被劃傷的玻璃表面將在顯微照片上顯示為鈍化區(qū)域，嵌入燈泡聚光玻璃或吸熱過濾器中的氣泡也將出現(xiàn)。通常這些氣泡在膠卷上記錄時會產(chǎn)生藍******調(diào)。擴散屏幕表面與屏幕玻璃內(nèi)的灰塵和碎屑或缺陷的污染（氣泡）導(dǎo)致顯微照片中的粉紅色或藍色斑點。
污垢和碎屑的另一個常見來源是樣品本身，其也位于共軛平面中。粘附在蓋玻片表面上的灰塵將作為未聚焦的暗點在薄膜上出現(xiàn)，而與蓋子接近或與樣品混合的污染物通常會以與樣品對焦的碎屑的形式出現(xiàn)。中間像平面附近的鏡頭上的灰塵和碎屑不常見，但有時會發(fā)生。該平面位于目鏡的固定隔膜上，當(dāng)目鏡從顯微鏡上取下并且*靠近固定隔膜的鏡頭變臟時，可能會被污染。
當(dāng)通過顯微鏡目鏡觀察污染物并嘗試找到源頭時，逐個慢慢地轉(zhuǎn)動每個目鏡，以確定碎屑點是否與其中一個目鏡一起旋轉(zhuǎn)。如果是這樣，那么污染就在目鏡本身上。當(dāng)試圖找到灰塵和碎屑的來源時，旋轉(zhuǎn)微孔鏡光學(xué)通路中的其他部件，如過濾器，投影鏡頭，相機系統(tǒng)和聚光鏡。在某些情況下，為了在組件旋轉(zhuǎn)時構(gòu)建記錄，捕獲顯微照片是有幫助的。還可以通過目鏡觀察來回轉(zhuǎn)動樣品，以確定碎片是否隨試樣移動。*后，
偶爾，纖維和棉絨可能會楔入場膜中的葉片之間或夾在相機或黑盒子內(nèi)的膠片載體中。當(dāng)這種情況發(fā)生時，碎片將以尖銳的焦點出現(xiàn)（見圖9（c））。這種類型的污染物更難以診斷，并且可能存在一些除去問題。如果現(xiàn)場隔膜中有碎屑，則應(yīng)使用經(jīng)驗豐富的維修工程師進行顯微鏡清潔。相機背面的碎片可以用壓縮空氣或駱駝毛刷去除。要清理鏡片，過濾器和標(biāo)本片上的污垢和碎屑，應(yīng)使用鏡片紙或軟棉簽仔細進行。使用一定距離的壓縮空氣或通過用駱駝毛刷輕輕擦拭，清除任何松動的污垢。
圖9顯示了除場曲率誤差外還顯示灰塵和碎屑污染誤差的幾個顯微照片。該標(biāo)本是感染雪松蘋果銹病的蘋果樹干多重染色薄片，這是一種影響洛磯山脈東部北美蘋果樹的疾病。它是由*Gymnosporangium juniperi-virginianae引起的，可以使樹木脫葉，瑕疵水果使其不能營銷。圖9（c）所示的顯微照片顯示了圖像上灰塵，碎片和焦點外斑點的嚴重污染的影響。這些偽影可以由許多原因產(chǎn)生，并且如上所述，碎片可以位于顯微鏡和/或樣品上的若干區(qū)域中。由于場曲率畸變引起的圖像聚焦問題困擾于圖9（a）中的顯微照片，其在邊緣具有清晰的清晰度，但在中心失去了焦點。這些錯誤將在后面討論。
亮點和鏡面反射 - 顯微照片上的亮點可能來自架空照明或來自外部光源的輔助照明的鏡面反射。當(dāng)在熒光顯微照相中進行非常長的曝光時，這些錯誤是特別普遍的。要解決這個問題，要么關(guān)掉架空燈（或輔助照明），要么覆蓋直接受影響的區(qū)域。在較老的顯微鏡上，當(dāng)在觀察雙目頭和光管之間使用分束器時，可能會發(fā)生類似的問題。通過將分束器調(diào)整到所有顯微鏡照明被引導(dǎo)到光控管中的位置來解決問題。當(dāng)沐浴在溶液中或通過使用長工作距離物鏡的非常厚的蓋玻璃和/或樣品架（*過1毫米）時，樣品成像時，反射也可能成為問題。通過厚玻璃進行成像時，不易固化，但通過使用水浸物鏡可以緩解水溶劑表面的反射。
當(dāng)常規(guī)單反相機與集成透鏡一起使用以拍攝圖像時，可能會發(fā)生顯微照片中的亮點。類似的點也是目鏡相機常見的，該目鏡相機具有位于顯微鏡投影透鏡上方的減速透鏡。相機鏡頭的前表面應(yīng)盡可能靠近投影鏡頭的眼點，以避免亮點。如果太靠近，則可將物鏡后透鏡的圖像作為離焦點記錄在膠片上。該點在透明膠片上顯得明亮，或者作為彩色或黑白底片上的黑點。這個問題通?？梢酝ㄟ^相機相對于照片目鏡或投影透鏡重新定位來減輕。為避免暈影，請注意不要將相機移動距離投影鏡頭太遠。
大多數(shù)物鏡由于在軸和離軸成像光波的路徑中的距離變化而顯示有限量的場曲率像差。在這種情況下，請使用精細對焦旋鈕將焦點從邊緣漂移到中心，以確認場曲率像差。用計劃物鏡替換未校正的物鏡，以解決像差問題。如果不可能進行客觀的更換，只要有可能，將顯微照相中記錄的區(qū)域限制在中心區(qū)域，或者安裝更高倍率的投影鏡頭以減小場尺寸。
霧帶 - 當(dāng)顯微照片顯示出霧化或沖洗的帶狀區(qū)域時，可能是由于在光線中非常短暫地打開相機而引起的。當(dāng)相機背面沿著鉸鏈或卡扣有輕微的泄漏時，也會發(fā)生這種情況。霧化程度取決于背部打開的時間長度和室內(nèi)光線的亮度。為了緩解這個問題，請確保在打開相機之前電影被完全倒帶。如果懷疑發(fā)生漏光，請合格的維修技術(shù)人員檢查相機。