尼康顯微鏡標(biāo)本的光學(xué)路徑長(zhǎng)度變化
尼康顯微鏡標(biāo)本的光學(xué)路徑長(zhǎng)度變化
相差顯微鏡解釋為波動(dòng)的光強(qiáng)度，這是很容易觀察到的變化在通過(guò)尼康顯微鏡的對(duì)比度在樣品光路長(zhǎng)度的差異。此交互式教程探索對(duì)表觀總光路長(zhǎng)度的折射率和厚度的變化的影響，并說(shuō)明了兩個(gè)試樣如何能有這些變量的不同組合，但仍顯示相同的路徑長(zhǎng)度。
教程初始化與兩個(gè)試樣（由灰色框表示）出現(xiàn)在窗口中，每一個(gè)都具有相同的光路的長(zhǎng)度，但具有的折射率和厚度的不同組合。雙相干平面波前 （題為波在階段）入射到試樣的左側(cè)面，并根據(jù)由所述滑塊設(shè)置為它們穿過(guò)變量的相位被修改。在離開(kāi)樣品時(shí)，波前可在相當(dāng)兩個(gè)樣品的光路長(zhǎng)度大致相等，或異相，如果路徑長(zhǎng)度差*過(guò)一個(gè)多微米的十分之幾。波前是藍(lán)色的，當(dāng)他們?cè)陔A段，但變成紅色時(shí)移出的相位。此外，該試樣被假定為通過(guò)空氣，其具有1.00的教程的目的折射率包圍。需要注意的是波前穿過(guò)樣品的實(shí)際數(shù)目是夸大為了便于說(shuō)明。
為了操作的教程，使用鼠標(biāo)光標(biāo)來(lái)翻譯折射率和試樣厚度滑塊的頂部和底部樣品。當(dāng)滑塊值被改變，所產(chǎn)生的試樣光路長(zhǎng)度（它等于折射率乘以厚度）的變化。試樣盒的灰度強(qiáng)度也降低（變暗）作為折射率增加。雖然大多數(shù)滑塊值將導(dǎo)致穿過(guò)成為異相（和標(biāo)題為標(biāo)本的波浪吹出階段）中，在滑塊設(shè)置若干組合會(huì)產(chǎn)生相同的樣本的光路長(zhǎng)度，其中離開(kāi)所述兩個(gè)試樣的波是同相的。訪問(wèn)者鼓勵(lì)嘗試各種滑塊設(shè)置，并觀察了廣泛的折射率和厚度的值可以導(dǎo)致具有相等的光路長(zhǎng)度的試樣。另外，在相對(duì) 于實(shí)際試樣尺寸的波前的尺寸被夸大了為了便于說(shuō)明，在教程。
在試樣和其周?chē)?a title='介質(zhì)' target='_blank' class='seolabel'>介質(zhì)之間的光程差來(lái)說(shuō)，與入射光波前橫穿檢體，但不穿過(guò)周?chē)橘|(zhì)的所述部分，稍微延遲。在相差顯微鏡參數(shù)，試樣中改變的光路長(zhǎng)度中的作用（在效果的相對(duì)相移）波通過(guò)的是非常重要的。在經(jīng)典光學(xué)，光路長(zhǎng)度（OPL）通過(guò)一個(gè)對(duì)象或空間的折射率（n）和所述對(duì)象的厚度（t）或所描述的關(guān)系居間介質(zhì)的產(chǎn)品：
光學(xué)路徑長(zhǎng)度（OPL）= n × t
當(dāng)光從一種介質(zhì)傳遞到另一種時(shí)，速度成比例地改變，以在兩個(gè)介質(zhì)之間的折射率差異。因此，當(dāng)通過(guò)聚焦顯微鏡燈絲發(fā)射的相干光波通過(guò)具有一定厚度的相位標(biāo)本噸和折射率（?），該波被增加或在速度降低。如果試樣的折射率大于周?chē)橘|(zhì)的，所述波在通過(guò)檢體并隨后被阻滯在相對(duì) 相位它出現(xiàn)時(shí)，從檢體減少速度。相反，當(dāng)樣品的折射率小于周?chē)橘|(zhì)，該波是在離開(kāi)試樣高級(jí)同相的。在試樣和周?chē)橘|(zhì)之間的突發(fā)波前的位置的差被稱(chēng)為相移（δ）和以弧度為定義為：
δ = 2πΔ/λ
在上面的公式中，術(shù)語(yǔ)Δ被稱(chēng)為光程差，這是類(lèi)似的光路長(zhǎng)度：
光程差（OPD）= Δ = (n2 - n1) × t
其中n（2）為試樣和的折射率n（1）周?chē)橘|(zhì)的是折射率。在正相位對(duì)比系統(tǒng)（其中所述非衍射光的波前由相位板中高級(jí)）時(shí)，如果樣品具有更大的光路長(zhǎng)度（較高的折射率）比周?chē)橘|(zhì)，它被成像為暗物體上的中性灰色背景。當(dāng)周?chē)橘|(zhì)具有比試樣的折射率高的情況是相反的。實(shí)際上，試樣出現(xiàn)明亮的上一個(gè)暗的背景。
如上所證實(shí)，該光程差導(dǎo)致的兩個(gè)項(xiàng)的乘積：試樣的厚度，并且其折射率與周?chē)橘|(zhì)的差異。在許多情況下，光程差可以是相當(dāng)大的，即使在試樣的厚度是小的。另一方面，光程差可以是零，甚至對(duì)大試樣的厚度，當(dāng)樣品的折射率等于該周?chē)橘|(zhì)。
對(duì)單個(gè)細(xì)胞在組織培養(yǎng)中，光程差是比較小的。單層培養(yǎng)的典型小區(qū)具有大約5微米的厚度和大約1.36的折射率。該小區(qū)由具有1.335的折射率，從而產(chǎn)生出含有0.125微米的光程差，或約四分之一波長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包圍。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生更小的相位差。這些小光程差產(chǎn)生的強(qiáng)度的線性減少而增加的相移（該圖像逐漸變暗生長(zhǎng)）到一個(gè)點(diǎn)（取決于相位板配置），在這之后，檢體的圖像變成通過(guò)反轉(zhuǎn)對(duì)比度亮。在相差顯微鏡，圖像的強(qiáng)度不承擔(dān)由檢體的整個(gè)厚度和折射率范圍所產(chǎn)生的光程差一個(gè)簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。相反，強(qiáng)度是取決于各種因素，包括吸收在該相位板，相位提前或延遲的相位板的程度，而這種相移的相對(duì)符號(hào)。