徠卡顯微鏡在鼠耳真皮的熒光免疫

徠卡顯微鏡在鼠耳真皮的熒光免疫

炎癥和重塑過程的活體成像一直是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域，并還激發(fā)了創(chuàng)造表達(dá)的熒光蛋白轉(zhuǎn)基因無數(shù)記者小鼠模型。我們的論文描述了一種新的體內(nèi)成像技術(shù)，它的設(shè)計(jì)是基于使用免疫染色對(duì)外科手術(shù)暴露的小鼠真皮活細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，而不會(huì)引起有害的免疫毒性作用的創(chuàng)新概念。在外科手術(shù)過程本身是安全的真皮脈管，因?yàn)樗鼉H依賴于兩個(gè)皮膚層在耳朵被獨(dú)立地支配，通過血液中自主供給和由分離淋巴環(huán)流排出分離。

結(jié)果 

**為止，免疫染色在活組織中通常不使用，由于形成免疫復(fù)合物，導(dǎo)致高背景染色和免疫毒性。我們克服由預(yù)阻斷的組織巨噬細(xì)胞的Fc受體結(jié)合，從而“致盲”這些細(xì)胞對(duì)隨后的間接強(qiáng)免疫染色這些大的問題。由于該標(biāo)記是細(xì)胞外，我們控制強(qiáng)的光毒性和漂白通過組織中的天然抗氧化劑浸泡，抗壞血酸（圖1）。

圖1：真皮活體染色和實(shí)時(shí)成像，可以Fcγ受體阻斷和抑制光毒性后。 （a）該耳的小后部區(qū)域首先接觸（虛線框），染色Lyve1并與第二抗體進(jìn)行檢測(cè)。接著，將整個(gè)耳朵被曝光后，阻止不相關(guān)的免疫復(fù)合物進(jìn)行15分鐘，并探討了如前。頂部邊界：無Fcγ受體阻斷，從一級(jí)和二級(jí)抗體之間形成并結(jié)合Fcγ受體對(duì)組織居民免疫細(xì)胞的免疫復(fù)合物高的背景效果。底部小圖：該背景主要是去與預(yù)先阻擋Fcγ受體的。 （二）光漂白*小化通過添加抗壞血酸，抗氧化劑，以林格氏緩沖該成像期間沐浴的耳組織。組織染色用抗IV型膠原蛋白和鏈霉親和的Alexa647（紅色）生物素化的抗體，然后不斷地成像為300秒中任一未改性林格氏緩沖液（上圖）或抗壞血酸鹽林格氏（下圖）;證明光漂白的程度，對(duì)像素強(qiáng)度值的亮的25％顯示為綠色（“高”）。需要注意的是抗壞血酸的保護(hù)效果可低估作為單個(gè)曝光時(shí)間為林格（對(duì)照）為227毫秒，而曝光時(shí)間為抗壞血酸是427秒。 （三）熒光衰減的定量隨時(shí)間（以林格氏對(duì)5％的抗壞血酸林格氏30％），歸一化到初始熒光，平均為3攝像視場(chǎng);標(biāo)準(zhǔn)誤差示由虛線和P<0.0001兩線之間。比例尺中，200微米; B，50微米。

我們還通過染色對(duì)基底膜的標(biāo)記，如實(shí)施的方法，所述組織微環(huán)境與血液和淋巴管，周細(xì)胞，神經(jīng)，肌肉和脂肪細(xì)胞的特定成像IV型膠原，而不是從非結(jié)構(gòu)性纖維膠原成像的二次諧波信號(hào)，基底膜蛋白。我們提出的實(shí)驗(yàn)裝置的詳細(xì)的設(shè)計(jì)和細(xì)節(jié)進(jìn)行成像的一系列重要的生理活動(dòng)*過12小時(shí)，包括血液和淋巴管之間白細(xì)胞運(yùn)輸。我們還實(shí)現(xiàn)這種技術(shù)用于成像腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，以及免疫細(xì)胞歸巢至腫瘤（未示出）。這些事件可以成像與同時(shí)記錄當(dāng)?shù)氐纳韰?shù)，如血管通透性和淋巴引流?；铙w免疫重要的還可以外趨化因子的商店與細(xì)胞遷移的事件相關(guān)聯(lián)。 

因?yàn)槎嫫缀跏嵌S的，我們可以很容易地收集，而不是更慢和更昂貴的共聚焦或多光子顯微鏡用熒光立體顯微鏡（圖2）這樣的數(shù)據(jù)，。在徠卡熒光立體顯微鏡主要光學(xué)嵌入顯微鏡支架，這會(huì)導(dǎo)致從16到320倍線性放大率內(nèi)。在該系統(tǒng)中，透鏡的主要功能是在同一時(shí)間使透鏡的工作距離是相對(duì)大的，收集的光的*大量（對(duì)于2X透鏡它為2cm的工作距離）。這與全自動(dòng)化相結(jié)合的階段，導(dǎo)致操縱和成像通常允許一個(gè)以上的耳朵在一次實(shí)驗(yàn)成像的舒適度。

圖2：在手術(shù)暴露耳朵背真皮血液循環(huán)的功能。 （一，二）明視場(chǎng)圖像，顯示血液循環(huán)（一）手術(shù)后立即（二）20分鐘，在相同的耳，其中，循環(huán)中的所有主要血管出現(xiàn)完全恢復(fù)之后。 （三）Lyve1染色（在不同的耳朵）示出了淋巴管的網(wǎng)絡(luò)，其中，所述耳部的前部不能與寬視場(chǎng)徠卡顯微鏡成像由于皮下組織的下層脂肪組織。 （四）TRITC葡聚糖通過淋巴管引流功能。 TRITC葡聚糖是在被染為IV型膠原的背部皮膚的頂皮內(nèi)注射。血管中的露出真皮（e）條的功能作為可視化與血管內(nèi)TRITC葡聚糖（紅色）表示損壞的血管（箭頭），該泄漏葡聚糖進(jìn)入間隙空間。 （六）血管通透性的靜脈后，IV型膠原染色耳組織評(píng)估注射155 kDa的TRITC葡聚糖。 （六）泄漏用30分鐘（Ctrl鍵;頂部）的基礎(chǔ)水平和在加入1μg/ ml的VEGF-A的（底部）后的同一組織中。 （克）的熒光強(qiáng)度，在血管外空間中作為時(shí)間的函數(shù)，表示血管滲漏的量化相對(duì)增加。示出的是平均值（三角形和正方形）和10的攝像視場(chǎng)的標(biāo)準(zhǔn)誤差（虛線）。 P<0.0001兩線之間。以下圖片來自同一實(shí)驗(yàn)（由分號(hào)隔開）：圖。 1a和1b;圖。 1C;圖。1D;圖。 1E;圖。 1F。比例尺中的a，b，和c2毫米; D，F(xiàn)，100微米;即，500微米。

在我們的出版物中，我們比較我們的技術(shù)，*設(shè)備，**的活體成像的各個(gè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。因此，我們觀察到前面描述的血管外滲和各類白細(xì)胞的免疫細(xì)胞進(jìn)入收集，而不是初始的淋巴管的**的可視化淋巴血管內(nèi)的事件。我們還發(fā)現(xiàn)從原位移植黑素瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞遷移的主要模式（未示出）。我們表明，在體內(nèi)，CCL21是能夠形成于收集，但只有很少的初始淋巴強(qiáng)，不連續(xù)的沉積。這是耐人尋味的，因?yàn)槭占萜饔?新的被忽略，因?yàn)槊庖呒?xì)胞進(jìn)入潛在門戶網(wǎng)站。事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)，皮膚樹突細(xì)胞和粒細(xì)胞能進(jìn)入收集淋巴管，觀察，不僅增加了位于集熱器的不連續(xù)的CCL21補(bǔ)丁的發(fā)現(xiàn)生理重要性，但它也可能在淋巴和CCL21的生物學(xué)切換模式作為血管內(nèi)到這種類型的船只都未曾觀測(cè)到。多么重要的發(fā)現(xiàn)可能是事實(shí)，非常類似我們的，但補(bǔ)充的觀察以及初始淋巴管弱，連續(xù)CCL21趨觸性梯度*近發(fā)表在科學(xué)韋伯等人。我們的紙補(bǔ)的Weber等人的研究，因?yàn)槲覀兲峁┝艘环N可能的解釋為對(duì)相比，收集那些初始淋巴強(qiáng)CCL21的沉積物相對(duì)不頻繁的定位。我們懷疑淋巴集熱器具有豐富的串珠素的存在和集聚蛋白的蜱基底膜，通過淋巴源性CCL21遇到的*個(gè)組織受體，是在捕獲肝素 - 結(jié)合的趨化因子相比，由基底膜弱支持初始淋巴管（圖更好3）。

圖3：現(xiàn)場(chǎng)染色只檢測(cè)外基底膜結(jié)合CCL21，而固定的組織染色上揭示了細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外CCL21。 （A-B）在活耳真皮CCL21在補(bǔ)丁（箭頭），并沿連續(xù)淋巴節(jié)段（箭頭）積累，和共定位用（一）串珠素和（b）IV型膠原，收集淋巴的兩個(gè)基底膜成分船只。 （三）偶爾觀察到CCL21陽性（綠色）初始淋巴管（ILY）染色更弱為IV型膠原蛋白（紅色）。 （四）外CCL21存款（綠色）看到周圍的露耳的皮膚淋巴管沒有與血管損傷相關(guān)領(lǐng)域，如通過靜脈確定TRITC葡聚糖（青色）可見，從受傷的血管（箭頭）組織染色的串珠素和CCL21后的區(qū)域泄漏。比例尺中的a，b和d（左），400微米; c和d（右），100微米的。

討論 

這種方法應(yīng)該是有趣的和有用的科學(xué)界，特別是在微循環(huán)，免疫學(xué)和腫瘤微環(huán)境，包括對(duì)腫瘤的血管生成和抗血管生成治療的研究領(lǐng)域。它具有一些優(yōu)于其它活體成像技術(shù)：（ⅰ）活體熒光成像已經(jīng)被用于在微循環(huán)研究，例如，從血液或淋巴管進(jìn)入跟蹤溶質(zhì)滲漏，但還沒有被結(jié)合的免疫染色。 （ⅱ）利用遺傳修飾的報(bào)告小鼠的允許為特定的細(xì)胞類型，以進(jìn)行成像，但要求它們的可用性（或大量的努力，以生成新的），并限制了可研究相互作用的細(xì)胞類型的數(shù)量。 （ⅲ）細(xì)胞外基質(zhì)可以被成像在利用二次諧波生成的體內(nèi)，但是這僅僅限于纖維狀膠原，留下大量的像基膜，纖連蛋白或生長(zhǎng)因子和趨化因子結(jié)合的糖胺聚糖夠不著對(duì)當(dāng)前研究的重要基質(zhì)。我們的方法克服了所有的這些限制，并進(jìn)一步允許引入標(biāo)準(zhǔn)的成像技術(shù)以及進(jìn)一步與免疫染色為其他類型的細(xì)胞，組織結(jié)構(gòu)，趨化因子的存款，或胞外基質(zhì)蛋白，而同時(shí)跟蹤血液或淋巴流。*后，這種方法受到重視它出版之前。該圖像示出黑素瘤細(xì)胞侵入淋巴活集電極船只被選擇作為自然綜述文章的封面圖像“跟蹤轉(zhuǎn)移和欺騙癌癥”。 

總之，這活免疫橋接實(shí)時(shí)，生理功能與在皮膚復(fù)雜的細(xì)胞事件的分子成像本地測(cè)量。此外，這種方法具有更大的潛力，因?yàn)樗梢院苋菀椎貞?yīng)用到如研究了血液和淋巴血管生成后的發(fā)育機(jī)制，移植排斥反應(yīng)的實(shí)時(shí)成像，或通過各種致病體可視化的皮膚感染的早期階段。例如，我們正在整理，其中通過使用這種活法，我們確定了線蟲感染和進(jìn)入淋巴管機(jī)制的手稿。我們也分析了在轉(zhuǎn)移和血管生成的腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)的異質(zhì)性的效果。憑借其靈活性和高通量的潛力這活技術(shù)，可以徹底改變生物學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域。