尼康顯微鏡熒光激發(fā)塊的雙激發(fā)組合

尼康顯微鏡熒光激發(fā)塊的雙激發(fā)組合

包括在尼康雙波段激發(fā)熒光濾光器組合是3每個(gè)包含兩個(gè)帶通發(fā)射區(qū)能夠通過(guò)藍(lán)色，綠色，黃色，橙色的窄頻帶，和紅光譜區(qū)域內(nèi)有選擇地分離出的熒光發(fā)射小心平衡組合。 這個(gè)交互式指南探討了變化的激發(fā)和發(fā)射濾光器的光譜分布，以及這些的多色反光鏡，如何影響在設(shè)計(jì)用于多重標(biāo)記的熒光基團(tuán)的雙激發(fā)組合信號(hào)電平，頻譜交叉，整體過(guò)濾器的性能，并且圖像的對(duì)比度紫外線和藍(lán)色或藍(lán)綠色的區(qū)域。

本教程使用初始化出現(xiàn)在樣品圖像窗口和紫外線藍(lán)色雙通帶濾波器的激發(fā)塊組合（DAPI-FITC;默認(rèn)值）隨機(jī)選擇的樣本的熒光光譜圖上的過(guò)濾器 ， 光譜曲線圖顯示。 熒光的吸收和發(fā)射光譜截面（帶過(guò)濾器的傳輸通帶重疊區(qū)域）可以通過(guò)選擇在光譜截面標(biāo)題中列出相應(yīng)的復(fù)選框（吸收或發(fā)射 ）單獨(dú)或集體觀看。 當(dāng)一個(gè)或多個(gè)復(fù)選框被激活，將合并的過(guò)濾器的透射和反射光譜被疊加在所選擇的熒光團(tuán)（多個(gè)）使用以標(biāo)記樣品（熒光光譜曲線中不包含自身熒光植物標(biāo)本）的吸收光譜和發(fā)射光譜。 熒光團(tuán)的吸收光譜示于使用褐色填充的教程，而相應(yīng)的發(fā)射光譜表示用灰色填充。 由過(guò)濾器設(shè)置滑塊指示的過(guò)濾器組合的波長(zhǎng)特性顯示在教程中下部的黑色矩形框。 這些值被不斷地更新作為滑板平移由左到右。

為了操作的教程，使用過(guò)濾器設(shè)置滑塊可用于雙頻勵(lì)磁三濾組合之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換。 當(dāng)滑塊從左向右平移，激發(fā)和阻擋濾光片的光譜分布，以及該多色鏡的，被修飾以模擬變化的光譜圖。需要注意的是連續(xù)變化的光譜曲線，但并不意味著任何過(guò)濾器的組合是可能的，也不是單獨(dú)的過(guò)濾器設(shè)置可變的（無(wú)物理變化的過(guò)濾器）的問(wèn)候的光譜曲線。 的選擇的濾波器組之間的頻譜分布的變化簡(jiǎn)單地用來(lái)幫助建立在每個(gè)光學(xué)塊中使用的過(guò)濾器的組合之間的關(guān)系。

各個(gè)過(guò)濾光譜 （激發(fā)，發(fā)射和多色反光鏡）可以通過(guò)選擇或取消選擇相應(yīng)的復(fù)選框，圖形下方的添加或刪除的過(guò)濾器 ， 光譜曲線圖。 此外，該熒光團(tuán)的吸收光譜和發(fā)射光譜可以被添加或與一組類似的復(fù)選框（ 頻譜截面 ）除去。 檢體圖像同時(shí)改變與過(guò)濾器配置文件以反映變化由改變到由滑塊的翻譯所產(chǎn)生的過(guò)濾器的組合產(chǎn)生的對(duì)比度和信號(hào)電平。 新的標(biāo)本可以在任何時(shí)候選擇使用選擇的樣本下拉菜單，用來(lái)標(biāo)記選定樣本的熒光基團(tuán)直接列在菜單框下方。在所有的情況下，將樣品粘有兩個(gè)或更多的熒光探針以證明熒光的具有窄和寬的通帶阻（發(fā)射）過(guò)濾套的選擇性分離。

每個(gè)尼康顯微鏡雙波段熒光集被優(yōu)化用于結(jié)合異硫氰酸熒光素（FITC）的使用與任一4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），四甲基羅丹明異硫氰酸酯（TRITC）或Texas染料。 對(duì)應(yīng)于這些熒光染料對(duì)相關(guān)的頻譜區(qū)的范圍從紫色激發(fā)和發(fā)射的藍(lán)光激發(fā)的綠色和紅色發(fā)光。 其他的熒光探針具有相似的光譜特性也是合適的，可單獨(dú)或成對(duì)，用于與尼康雙重激發(fā)熒光濾光片組合使用。

尼康DAPI-FITC雙帶濾波器組合結(jié)合具有一個(gè)帶通區(qū)域的紫色激發(fā)塊（400?418納米），連接到一個(gè)帶通發(fā)射（屏障）過(guò)濾器發(fā)射藍(lán)色熒光（450?465納米）激發(fā)濾光片在其信號(hào)的樂(lè)隊(duì)之一。 第二激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)組合此過(guò)濾器集使藍(lán)色激發(fā)在478至495納米的窄帶和檢測(cè)所產(chǎn)生的綠色熒光，在510到555納米范圍內(nèi)的。 此過(guò)濾器設(shè)定功能的雙頻段提供最佳的同時(shí)檢測(cè)DAPI和FITC，當(dāng)結(jié)合使用，專門針對(duì)不同的細(xì)胞成分。 在DAPI - 的Alexa Fluor 488的熒光染料對(duì)適用于該過(guò)濾器設(shè)置，以及，由于在問(wèn)候的吸收和發(fā)射特性的Alexa Fluor探針和FITC光譜曲線的緊密相似性。

在雙激發(fā)濾鏡立方體，多色鏡的設(shè)計(jì)是至關(guān)重要的兩個(gè)熒光信號(hào)的分離，最好使它們具有最小串?dāng)_和噪聲的獨(dú)特的檢測(cè)。 而相比之下，在常規(guī)的組合中使用的標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)通分光濾波器，多頻帶濾波器組聘請(qǐng)改性二色性反射鏡與被精確地定位相對(duì)于所述多個(gè)激發(fā)和發(fā)射頻帶的多個(gè)帶通區(qū)域。 第一（下部）切于波長(zhǎng)值的反射鏡定位在幾納米比短波長(zhǎng)激發(fā)峰高，并開(kāi)始一個(gè)傳輸頻帶完全圍繞對(duì)應(yīng)的發(fā)光峰值，隨后突然傳輸截止。 這種設(shè)計(jì)使波長(zhǎng)的反射在第二激發(fā)帶，同時(shí)經(jīng)過(guò)了第一支樂(lè)隊(duì)創(chuàng)建的熒光發(fā)射。 在波長(zhǎng)只是稍微比第二激發(fā)帶越高，反射鏡使另一個(gè)尖銳過(guò)渡到對(duì)應(yīng)于所述第二發(fā)射通帶的帶通透射區(qū)域。 在DAPI-FITC激發(fā)塊組合使用的多色鏡具有適當(dāng)?shù)匚挥谙鄬?duì)于每個(gè)激發(fā)塊補(bǔ)體，是具有一個(gè)截止波長(zhǎng)為435納米，和另一個(gè)與截止波長(zhǎng)的兩個(gè)帶通透射區(qū)域505納米。

薄膜干涉技術(shù)中的多頻帶濾波器組的制造技術(shù)的應(yīng)用使得有可能以平衡的兩個(gè)（或更多）的熒光染料的熒光信號(hào)電平并提供最佳的攝像條件。 在許多過(guò)濾器的組合中，更短的（通常為紫外光或紫色）波長(zhǎng)的激發(fā)峰的發(fā)送頻帶信息被減少，以平衡的發(fā)射信號(hào)電平，以及以最小化光致漂白和試件破壞。 這是在套設(shè)計(jì)用于與一種熒光團(tuán)激發(fā)的紫光或紫外光譜區(qū)，使用特別重要，因?yàn)槎滩ㄩL(zhǎng)輻射的高激發(fā)效率。 短波長(zhǎng)激發(fā)峰的強(qiáng)度降低是在過(guò)濾器的組合，例如尼康DAPI-FITC組的透射光譜曲線的顯著特點(diǎn)。

用于同時(shí)檢測(cè)FITC標(biāo)記的（或類似的熒光團(tuán)），并激發(fā)在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)，如TRITC的探針，所述的FITC-鬼筆雙頻帶濾波器組合提供藍(lán)色區(qū)域的激發(fā)綠色發(fā)光檢測(cè)，和綠色激發(fā)伴隨橙紅色排放檢測(cè)。 在此濾波器組，帶通區(qū)域?yàn)樗{(lán)色激發(fā)綠色發(fā)光熒光素（FITC等）是從那些在DAPI-FITC集，以便最小化串?dāng)_的吸收綠光的熒光團(tuán)采用稍加修改。 在這個(gè)組中使用的激發(fā)濾光器具有475至490納米（藍(lán)色激發(fā)），耦合到的503至530納米的發(fā)射（阻擋）濾波器的通帶（綠色發(fā)光），其是適合于FITC和類似的熒光團(tuán)1的帶通區(qū)域。

FITC-TRITC濾光器組合的第二個(gè)頻帶使得激發(fā)塊在540?565納米的綠光波長(zhǎng)范圍內(nèi)，并且檢測(cè)對(duì)應(yīng)于580和620納米之間的區(qū)域中的橙紅色發(fā)射。 雖然對(duì)FITC和TRITC熒光團(tuán)的流行組合最優(yōu)化，也可以使用探針具有相似的吸收和發(fā)射光譜特性。 多色鏡（分束器）的帶通區(qū)域分別位于對(duì)應(yīng)于激發(fā)和發(fā)射濾波器的窗口，在500和575納米的切口上的波長(zhǎng)。

同時(shí)檢測(cè)FITC的（或類似的探針），并激發(fā)在綠色和黃綠色光譜區(qū)波長(zhǎng)熒光染料，具有發(fā)射延伸到紅，由FITC-Texas濾光片組承擔(dān)。 激發(fā)塊頻帶為這個(gè)集（藍(lán)色和綠色光譜區(qū)）的范圍從490至505納米，并且從560到580納米。 相應(yīng)的雙綠色和紅色發(fā)射頻帶是515至545納米和600至650納米，分別。 互補(bǔ)多色鏡切口上的波長(zhǎng)的兩個(gè)信號(hào)的傳輸帶分別位于510和585毫微米。 規(guī)格為多色反光鏡和濾光片的三個(gè)尼康雙頻帶濾波器的組合列于表1中。

• DAPI-FITC -的DAPI-FITC過(guò)濾器組合被設(shè)計(jì)成用于同時(shí)從熒光染料DAPI和FITC或其它配對(duì)具有相似的光譜特性的熒光探針的檢測(cè)發(fā)射。 雙窄的激發(fā)和發(fā)射頻段對(duì)應(yīng)于紫色激發(fā)的特定區(qū)域與相應(yīng)的藍(lán)色發(fā)光和藍(lán)色激發(fā)塊耦合到綠色發(fā)光。

• FITC-TRITC -的FITC-TRITC濾光片組合是專為從熒光FITC和TRITC或探針對(duì)那些相似的光譜同時(shí)檢測(cè)排放。 帶通激發(fā)和發(fā)射濾光片允許兩個(gè)信號(hào)通道，一個(gè)對(duì)應(yīng)于藍(lán)色激發(fā)綠色發(fā)光，另一個(gè)為綠色激發(fā)和橙紅色發(fā)射的特定的窄的區(qū)域。

• FITC-Texas Red -使用FITC-Texas Red濾光片組合的設(shè)計(jì)稍有不同的帶通區(qū)域?yàn)樗{(lán)色激發(fā)綠色發(fā)光時(shí)相比，F(xiàn)ITC-TRITC集，允許FITC標(biāo)記的更有效的激發(fā)塊。這些變化符合稍高的波長(zhǎng)范圍為德克薩斯紅（綠色激發(fā)塊;紅色發(fā)光）頻段。 多帶通地區(qū)的用戶提供最佳的檢測(cè)，以最小的串?dāng)_，對(duì)FITC和Texas或類似的光譜熒光雙同步可視化。