尼康顯微鏡色差和光暈環(huán)相差偽像

尼康顯微鏡色差和光暈環(huán)相差偽像

兩個(gè)在相位對(duì)比圖像觀察到的非常常見的效果與特征色差和光暈圈圖形，其中所觀察到的強(qiáng)度并不直接對(duì)應(yīng)于檢體和周圍介質(zhì)之間的光程差（折射率和厚度的值）。這種互動(dòng)式的教程演示正負(fù)相差顯微鏡色差的文物。

本教程以初始化出現(xiàn)在半透明的藍(lán)色矩形試樣在窗口的左側(cè)。相鄰的標(biāo)本是一個(gè)模擬相襯視場(chǎng)（有權(quán)理想人格形象，直至色差滑塊翻譯）描述如何樣的姿態(tài)出現(xiàn)在理想的無偽影的情況下，在尼康顯微鏡。在窗口的右手側(cè)是橫跨沿著x軸試樣的中心所取的線強(qiáng)度的掃描曲線圖。該掃描顯示了相對(duì)于所述背景樣品的強(qiáng)度分布。

為了操作的教程，使用鼠標(biāo)光標(biāo)移動(dòng)到翻譯色差度滑塊到右邊，這將增加該神器的嚴(yán)重性。作為色差截止值增加，在色差圖像窗口中的試驗(yàn)片的外觀被改變，以反映改變的標(biāo)本圖像。增加色差和光暈工件的水平再分配強(qiáng)度在試樣的中心，并產(chǎn)生周圍光暈。同時(shí)，該線強(qiáng)度的掃描信息被改變，以與改變的標(biāo)本圖像對(duì)應(yīng)。標(biāo)本的對(duì)比，可以進(jìn)行正相襯，負(fù)相襯的單選按鈕之間進(jìn)行切換逆轉(zhuǎn)。

雖然色差和光暈型態(tài)發(fā)生的相位相反的光學(xué)系統(tǒng)的自然結(jié)果，它們通常被稱為相位偽影或圖像失真。在所有形式的正相位相反，明亮的相光暈通常包圍大樣本的特征和介質(zhì)之間的界限。相同的光環(huán)似乎比負(fù)相襯光學(xué)系統(tǒng)的樣本顏色較深。這些效果是由光程差的波動(dòng)，它可以變成明亮的暗光暈正相襯，明亮負(fù)相襯暗光暈進(jìn)一步加劇。

光暈圈出現(xiàn)在相差顯微鏡下，因?yàn)槲挥?/span>物鏡相板的環(huán)形相位延遲（和中性密度）環(huán)也發(fā)送一個(gè)小的程度衍射光從檢體（它不局限于僅通過環(huán)繞波）。該問題是由以下事實(shí)的零階環(huán)繞的波陣面投影到相板由聚光環(huán)帶的寬度比所述相位差板環(huán)的實(shí)際寬度小復(fù)雜。在相位環(huán)和環(huán)繞的波陣面之間的寬度之差，通常是大約25％至40％，但是必要的，因?yàn)橄拗坪凸鈱W(xué)設(shè)計(jì)的要求。因?yàn)樵谖镧R衍射面的相位環(huán)的空間位置，只有那些對(duì)應(yīng)于由樣品衍射的低空間頻率的波前穿過相板的環(huán)狀空間。因此，通過相位板衍射試樣波保持90度（四分之一波長(zhǎng)）進(jìn)行相對(duì)相位的零階（undeviated或環(huán)繞）的光。所得到的相位相反光暈工件是由于衰減的通過一個(gè)非常小的角度相對(duì)于該零階環(huán)繞的波陣面的衍射由樣品中的低空間頻率信息。實(shí)際上，不存在由樣品和undeviated光波衍射低空間頻率的波陣面之間的相消干涉的產(chǎn)生一局部對(duì)比度反轉(zhuǎn)（由光暈表現(xiàn)）周圍的檢體。為了創(chuàng)建該圖像的銳利邊緣，所有的試樣衍射的空間頻率，必須在*終圖像來表示。

相襯光暈特別突出和顯著四周大，低空間頻率的物體，如細(xì)胞核，硅藻和整個(gè)細(xì)胞。另一個(gè)因素為光暈工件是光能量在圖像平面上的重新分布，從地區(qū)，它是破壞地區(qū)，它是建設(shè)性的。大，高對(duì)比度光暈可以為試樣產(chǎn)生大的光程差，如紅細(xì)胞，霉菌，原生動(dòng)物，酵母細(xì)胞和細(xì)菌產(chǎn)生混亂的圖像。另一方面，光暈效果往往強(qiáng)調(diào)試樣和其周圍的背景之間的對(duì)比度差異，并能提高在許多樣品的薄邊和邊界的信息的可視性。這種效應(yīng)是負(fù)相位相反，從而產(chǎn)生周圍的低頻圖像細(xì)節(jié)的暗暈特別有幫助。在許多情況下，它能夠減少相移和衍射的程度，導(dǎo)致周圍的樣品降低光暈的大小。*簡(jiǎn)單的補(bǔ)救用于除去或減輕光暈的強(qiáng)度是修改具有較高折射率的成分，如甘油，甘露糖醇，葡聚糖，或血清白蛋白的觀測(cè)介質(zhì)的折射率。在某些情況下，改變介質(zhì)的折射率甚至可以產(chǎn)生反轉(zhuǎn)圖像對(duì)比度，把暗標(biāo)本設(shè)有明亮而不顯著干擾背景強(qiáng)度。

光暈環(huán)效應(yīng)可通過利用包含周圍的物鏡后孔附近的相位環(huán)材料中性密度材料制成的小環(huán)專門設(shè)計(jì)階段物鏡來顯著降低。這些物鏡被稱為切趾相襯的物鏡，使具有大的相位差來觀看和拍照，清晰度和細(xì)節(jié)的定義階段對(duì)象的結(jié)構(gòu)。在大多數(shù)情況下，細(xì)胞內(nèi)的功能（如核仁）可以明確識(shí)別為具有與已切趾的物鏡暗的對(duì)比度，但這些相同的特征，具有明亮的光暈或者被成像為使用常規(guī)的相位對(duì)比光學(xué)亮點(diǎn)。與切趾光學(xué)對(duì)比度由于衍射光相對(duì)于直射光穿過樣品的大振幅扭轉(zhuǎn)。 

在實(shí)踐中，光暈減少和增加樣品的對(duì)比度和變跡的光學(xué)系統(tǒng)可通過位于鄰近于在后焦面內(nèi)置到物鏡的相位板的相位膜的選擇性振幅濾波器的使用來實(shí)現(xiàn)。這些振幅濾波器由施加到相位膜周圍的相位板的中性密度過濾器的薄膜。在古典相位板的相位偏移環(huán)的透射率約為25％，而對(duì)周圍的切趾板的相移圈相鄰的環(huán)的具有中性密度以50％的透射率。相位膜的兩個(gè)板的寬度是相同的。這些值與相移施加到標(biāo)準(zhǔn)板在相襯顯微鏡的薄膜的透射率的值是一致的。

光暈在相差顯微鏡另一個(gè)很常見的光學(xué)神器，而且往往是在大，延長(zhǎng)階段，標(biāo)本*容易變化。它通常會(huì)被預(yù)期具有橫跨直徑恒定的光程長(zhǎng)度大的相位標(biāo)本的圖像會(huì)出現(xiàn)均勻的暗或亮的顯微鏡。不幸的是，通過相差顯微鏡產(chǎn)生的圖像的亮度不總是承受由試樣產(chǎn)生的光程差一個(gè)簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。其它因素，如吸收的相位板和相位延遲或提前量，以及相位環(huán)和聚光環(huán)形帶的相對(duì)的重疊大小也起著至關(guān)重要的作用。一個(gè)大的，厚度均勻的正相位對(duì)比試樣的強(qiáng)度分布往往逐漸從邊緣到中心，其中所述光強(qiáng)度的中心區(qū)域可以接近其周圍介質(zhì)的增加（相反的是真正的負(fù)相位標(biāo)本）。這種效應(yīng)被稱為色差，并檢查擴(kuò)展平面標(biāo)本，如材料板（玻璃或云母），復(fù)制品時(shí)經(jīng)常觀察到，扁平組織培養(yǎng)細(xì)胞和大細(xì)胞器。 

光環(huán)和正反兩方面的相襯色差文物的影響列于圖1為具有矩形幾何形狀，比周圍介質(zhì)的折射率高一個(gè)假想的延長(zhǎng)階段，樣品（圖1（a））。通過樣品的中心區(qū)域記錄的強(qiáng)度分布示于圖1（b）所示。在正相位對(duì)比（圖1（c））中，樣品的圖像顯示出鮮明亮麗光暈和演示了戲劇性的色差效應(yīng)，這是由逐漸增加的強(qiáng)度從邊緣到該試樣的中心區(qū)域遍歷時(shí)表現(xiàn)出來（見強(qiáng)度分布在圖1（d））。光環(huán)和色差效應(yīng)已扭轉(zhuǎn)負(fù)相位對(duì)比（圖1（e）和1（f））的強(qiáng)度。甲暗暈圍繞標(biāo)本圖像與負(fù)相位對(duì)比光學(xué)器件（圖1（e））的觀察時(shí)，與從明亮的樹蔭斷過渡范圍的邊緣，以更暗的灰度級(jí)中的中心。此外，該強(qiáng)度分布（圖1（f））的是從與正相位對(duì)比觀察扭轉(zhuǎn)。 

色差現(xiàn)象通常也稱為區(qū)--的動(dòng)作的效果，因?yàn)榫哂芯鶆虻暮穸?，在試樣中部區(qū)域衍射光不同于高折射區(qū)域，在邊緣和邊界。在檢體的中央?yún)^(qū)域，這兩個(gè)相對(duì)量和衍射光的角度時(shí)相比，邊緣被顯著地減少。因?yàn)檠苌涞牟嚸鎻闹醒朐嚇訁^(qū)域始發(fā)具有從零階非偏斜環(huán)繞的波前只有邊際的空間偏差（但仍然滯后于相位由四分之一波長(zhǎng)），它們是由在物鏡后方的相位板捕獲焦平面，伴隨著環(huán)繞的光。其結(jié)果是，中央檢體區(qū)域的強(qiáng)度基本保持相同的背景的。色光降效應(yīng)在相對(duì)平坦的平面試樣的區(qū)域的外觀，連同由邊和邊界產(chǎn)生的過高的對(duì)比度提供了強(qiáng)有力的證據(jù)表明，相位相反的機(jī)制主要是由衍射和散射的組合現(xiàn)象的控制。 

光暈和色差工件取決于兩者的幾何和光學(xué)相位板的特性和被檢查的樣品。特別是，相環(huán)的寬度和透射率控制這些效果發(fā)揮關(guān)鍵作用（相位環(huán)的寬度通常是大約十分之一的物鏡的總開口面積）。為減少透光率更廣泛的相位環(huán)往往會(huì)產(chǎn)生更高強(qiáng)度的光環(huán)和色差關(guān)閉，而環(huán)徑對(duì)效果的影響較小。對(duì)于一個(gè)特定的階段物鏡（或正或負(fù)）時(shí)，光程差和樣品尺寸，形狀和結(jié)構(gòu)有光暈和色差效應(yīng)的嚴(yán)重性顯著影響。此外，這些效果是由物鏡放大倍數(shù)的嚴(yán)重影響，以生產(chǎn)更好的圖像放大倍數(shù)較低。