尼康顯微鏡超分辨率顯微鏡的分子密度

必須以單分子*分辨率成像被認(rèn)為是關(guān)鍵的方面是每個(gè)單獨(dú)的定位測(cè)量的精度，這已被定位于*終圖像（通常被稱(chēng)為分子密度）探針的密度，和標(biāo)簽本身的物理尺寸。分辨率和單個(gè)分子的定位精度之間的關(guān)系容易地確定。解決兩種熒光分子作為單獨(dú)的實(shí)體的能力是由定位精度，這就決定了每個(gè)分子的位置（和不確定性），從而所述一對(duì)之間的距離的限制。定位的精度，進(jìn)而，主要取決于在一個(gè)單一的激活失周期從熒光分子收集光子的數(shù)目，所提供的背景噪聲可以忽略不計(jì)。這種互動(dòng)式的教程探討分子密度和圖像分辨率的概念。

本教程初始化了尼康顯微鏡一組定位點(diǎn)在窗口稀疏，代表在一個(gè)虛擬的樣本低程度的分子密度。為了操作的教程，使用局部分子密度滑塊增加局部分子的數(shù)目，并因此出現(xiàn)在窗口中的圖像的分辨率。在*高的分子密度，很好的標(biāo)本細(xì)節(jié)變得明顯。一種新的樣品可以使用下拉菜單來(lái)選擇。 

分子密度和*終圖像的分辨率之間的關(guān)系是在奈奎斯特采樣定理，這要求每解析單元大約兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)而言*好的說(shuō)明。在將標(biāo)記效率（在效果的指標(biāo)分?jǐn)?shù)被標(biāo)記的）的試樣的情況下是不夠的，工件如不連續(xù)精細(xì)結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)可以出現(xiàn)在*分辨的圖像。必要局部熒光探針因此，對(duì)于具有尺寸α的空間特征的二維圖像時(shí)，所需的*小的分子密度，以滿足奈奎斯特準(zhǔn)則是：

Nyquist Molecular Density ≈ (2/α)2(1)

因此，例如，為了實(shí)現(xiàn)20納米的分辨率在兩個(gè)維度，一是熒光團(tuán)必須位于至少每10納米，并且需要為每平方微米約10,000個(gè)分子的一個(gè)非常高的分子密度。對(duì)于*高分辨率的三維空間，20納米的分辨率要求每立方微米約一百萬(wàn)的熒光。在實(shí)踐中，低得多的分子密度常常是足夠的，當(dāng)試樣的幾何形狀考慮在內(nèi)。生物結(jié)構(gòu)往往異構(gòu)使得即使具有相對(duì)高的豐度靶位點(diǎn)的飽和度標(biāo)記可導(dǎo)致較低的總密度。在一般情況下，熒光探針的足夠的密度必須存在，才能充分映射的標(biāo)記結(jié)構(gòu)的精細(xì)的細(xì)節(jié)。用相同的標(biāo)準(zhǔn)，這些熒光探針的足夠數(shù)量必須成功地在成像過(guò)程中的局部。

在單分子的*分辨技術(shù)通過(guò)采用光開(kāi)關(guān)的熒光團(tuán)（例如PALM和STORM）在時(shí)間上分離的熒光發(fā)射，的開(kāi)和關(guān)的切換動(dòng)力學(xué)的比率是一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)應(yīng)該是微調(diào)的分子密度。在上面描述為每平方微米萬(wàn)的熒光團(tuán)的分子密度，以實(shí)現(xiàn)20納米的橫向平面上的*終分辨率的情況下，大約600個(gè)熒光團(tuán)必須駐留在點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的橫向投影。這種高分子的密度可以通過(guò)一個(gè)事實(shí)，即大多數(shù)光開(kāi)關(guān)熒光團(tuán)都沒(méi)有在他們的暗狀態(tài)，從而導(dǎo)致高背景噪聲而變得復(fù)雜。這些熒光團(tuán)或者發(fā)出微弱熒光，或者它們可以自發(fā)地切換到熒光狀態(tài)，在完全不存在激活的照明。非特異性的活化可以是自發(fā)的或工件可以由成像激光誘導(dǎo)。在情況下，分子的密度非常高，大量的非特異性激活的熒光團(tuán)可以生成單分子圖像重疊，從而影響到實(shí)現(xiàn)高精度定位的能力。因此，建議采用了具有低暗態(tài)排放，低非特異性激活率光開(kāi)關(guān)的熒光。 

示于圖1是涉及影響在單分子*分辨率成像的空間分辨率的*關(guān)鍵因素之一，一個(gè)重要的概念。該決議與分子密度圖1表示為一系列黃色像素的測(cè)試圖案?？赡艽嬖谟跇颖镜奶卣鬟M(jìn)行成像以逐漸降低的信號(hào) - 噪聲比作為分子密度減?。◤牡撞康綀D1的頂部）（測(cè)量像素的分?jǐn)?shù)），這些功能變得不可解析時(shí)的平均分子分離方法的特征尺寸（圖1中*上面一行）。因此，如公式（1）中，為了實(shí)現(xiàn)在尺寸n倍更高分辨率D，ND倍的像素必須被獲取的。為了不影響任一所述成像速度或信號(hào) - 噪聲比，信號(hào)采集速率（每秒檢測(cè)到的光子）來(lái)實(shí)現(xiàn)這樣的分辨率增益必須由至少ND，這需要的因子增加ND倍高暴露于每個(gè)圖像的激發(fā)激光必需的。 

中的時(shí)間分辨率來(lái)說(shuō)，單分子基礎(chǔ)的*分辨率的方法不直接產(chǎn)生一個(gè)圖像，而是被用于映射個(gè)從數(shù)千的個(gè)攝像幀確定的特定分子的本地化。在這種情況下，時(shí)間分辨率是由所需要獲得合適的圖像成像的幀的數(shù)目來(lái)確定。此外，Palm和暴風(fēng)影音成像用于光開(kāi)關(guān)的熒光基團(tuán)的性質(zhì)，可對(duì)時(shí)間的成像速度的限制。熒光蛋白是優(yōu)良的，用作在例基因編碼的探頭，其中定位于特定的亞細(xì)胞區(qū)室或生物分子的裝配是必需的。然而不幸的是，熒光蛋白顯示出相對(duì)緩慢的光控動(dòng)力學(xué)相比，許多合成的探針，如Cy5標(biāo)記和Alexa Fluor647，后者可以表現(xiàn)出高開(kāi)關(guān)速度，使1毫秒的攝像周期在大約30納米，這是一個(gè)高分辨率的幅值大于那些熒光蛋白獲得的幾個(gè)數(shù)量級(jí)。開(kāi)關(guān)周期的速度，以幫助確定單分子*分辨率顯微鏡的時(shí)間分辨率將是在適應(yīng)這種方法活細(xì)胞成像的**限制。