光學(xué)結(jié)構(gòu)的寬光譜劃歸審議過程中儀器開發(fā)的全內(nèi)反射熒光顯微鏡檢查（TIRFM）的早期階段。從這一努力出現(xiàn)一個數(shù)字，滿足在不同折射率的兩種材料之間的接合處產(chǎn)生的薄漸逝場的要求設(shè)計的。
在倒置顯微鏡下為這些設(shè)計的大部分，主要是由于添加TIRFM光學(xué)上的方便，而不是下面，笨重的顯微鏡臺。立式顯微鏡的結(jié)構(gòu)也可以利用，尤其是當(dāng)這是唯一可行的選擇，實驗條件或調(diào)查員的預(yù)算。與生長的細胞在單層培養(yǎng)在塑料培養(yǎng)皿底細胞基質(zhì)接觸的觀察是一種直立顯微鏡很好的候選人，尤其是當(dāng)與浸漬的錐體采用水浸的物鏡。倒置顯微鏡更有效時，檢查細胞或膜組件連接到一個密封的標(biāo)本室上部或當(dāng)物鏡是用來照亮和檢索從試樣的二次熒光發(fā)射。
無論基本的顯微鏡的設(shè)計，大多數(shù)目前使用的TIRFM結(jié)構(gòu)依賴增加棱鏡激光直接光照往何處發(fā)生全內(nèi)反射界面，這是樣品中的共聚焦平面的顯微鏡。也可以用顯微鏡物鏡的同時直接照射到接口和實現(xiàn)第二熒光發(fā)射的激發(fā)熒光基團產(chǎn)生。本文討論了許多的TIRFM基本的顯微鏡的結(jié)構(gòu)，并假定例標(biāo)本是在組織培養(yǎng)中的一個或多個熒光染料標(biāo)記，在單層附著在玻璃蓋玻片在全內(nèi)反射界面生長的細胞。
圖1中給出的是一個典型的TIRFM儀器結(jié)構(gòu)涉及一個倒置的組織培養(yǎng)顯微鏡，梯形棱鏡塊，外加激光照明，和一個光電倍增管/ CCD探測器系統(tǒng)的組合。發(fā)出的激光經(jīng)過先擴束后成一個分束器將顯微鏡入口端口和梁主任鏡之間的淡藍色的光。在導(dǎo)演的鏡面反射，光的一部分被聚焦透鏡到梯形棱鏡放置在顯微鏡載物臺上方的標(biāo)本室和物鏡集中。棱鏡把光照在一個角度，略大于內(nèi)部全反射的臨界角的TIRF接口，創(chuàng)建一個漸逝場激發(fā)熒光的樣品。光的分束器通過另一部分進入顯微鏡的港口，在那里它可以被引導(dǎo)通過光培養(yǎng)寬視場落射熒光激發(fā)試樣。二次熒光的樣品發(fā)射的物鏡是收集并傳遞到目鏡的CCD攝像系統(tǒng)，光電倍增管（PMT），或。由于梯形棱鏡的頂是平的，從鎢鹵素光源照明可以用來觀察樣品在透射模式使用一系列的對比增強技術(shù)，包括微分干涉相襯，相對比，暗視野，和霍夫曼調(diào)制對比度。
當(dāng)設(shè)計TIRFM實驗，在構(gòu)型的主題考慮的最重要的因素是照明的臨界角。普通的玻璃蓋玻片上，在組織培養(yǎng)細胞通常生長，有約1.52的折射率的介質(zhì)時，周圍的細胞和細胞內(nèi)成分的折射率的范圍從1.33到1.38。因此，在細胞膜和蓋玻片之間的接口獲得全內(nèi)反射（N（2）／n（1）＝1.52／1.38），入射角必須大于65度的臨界角。如果細胞是不完整的和已透，溶血，超聲處理，或固定，然后低折射率的水性緩沖液（N（1）= 1.33）而不是細胞質(zhì)，和臨界入射角度減少到61度。
奧林巴斯顯微鏡在原則上，可以采用傳統(tǒng)的鹵鎢或汞/氙弧燈進行技術(shù)試驗，但大多數(shù)的文獻報道的調(diào)查是在激光照射下進行。激光器是如此廣泛的首選的最主要的原因是，激光是相干光，偏振，和準(zhǔn)直，這樣就可以很容易地引導(dǎo)到物鏡或棱鏡擴束鏡，使用標(biāo)準(zhǔn)，和聚焦透鏡。當(dāng)激光源是正確對齊，全內(nèi)反射界面被定義的幾何形狀，可以很容易地調(diào)整，以適應(yīng)變化的區(qū)域試驗。高強度的激光源，也為實驗要求的照明相當(dāng)重要，如熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）的調(diào)查和熒光比率測定。
為tirmf實驗最流行的激光源是1至3瓦的空氣和水冷卻的連續(xù)波氬離子系統(tǒng)，在488和514納米，具有很強的發(fā)射線，提供廣泛的普通熒光激發(fā)的能力。在較長的波長具有線激光器，如氦、氖、氪離子氣體激光器，可用于激發(fā)熒光團的吸收在540納米和較高的地區(qū)。然而，幾乎所有的激光在0.5瓦的總可見輸出或更大的范圍應(yīng)該足夠了。激光源是一般可取為TIRFM弧燈，因為在強度嚴重降低電弧燈發(fā)出的光準(zhǔn)直的結(jié)果。然而，激光照射有不可避免的干擾邊緣上的試樣，可以通過精心清洗光學(xué)表面有所降低。臨界實驗，研究者應(yīng)該探索快速抖動的激光束，或至少計算一個正常的使用由一個均勻的熒光團的濃度控制的數(shù)字圖像樣本的數(shù)字圖像。
倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)
為了實現(xiàn)在倒置顯微鏡下培養(yǎng)室全內(nèi)反射的激光直接照射在玻璃立方體放置在腔室頂部的最簡單的方法，如圖2所示。在一般情況下，一個固定的顯微鏡（物鏡轉(zhuǎn)盤/物鏡組合是翻譯在聚焦）比移動臺顯微鏡更方便。這種結(jié)構(gòu)使試件將聚焦的過程中保持靜止，只需要對激光束的初始對準(zhǔn)。然而，移動臺顯微鏡是更常見的，兩種類型可用于這些實驗。
在倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)被認為是在這里，緩沖區(qū)填充的樣品室由一個較低的赤裸的蓋玻片，60微米厚的聚四氟乙烯墊片環(huán)，和細胞粘附蓋玻片倒使細胞的臉朝向物鏡。這種設(shè)計的優(yōu)點是細胞沒有綁定到基板，松散的細胞碎片，和污染蛋白傾向于沉積物作為一個集合到室底無遮蔽或添加外源熒光全內(nèi)反射界面。
單層細胞的蓋玻片組合的上表面被放置在與玻璃塊光接觸（或棱鏡）由一層薄薄的浸油或甘油的方法。玻璃塊的側(cè)面應(yīng)固定，但樣品必須能夠接受的翻譯在x和y方向的同時仍然保持光學(xué)接觸。下蓋可以過大和聚四氟乙烯墊片通常是有差距，緩沖溶液浸泡的細胞可通過毛細管作用具有入口和出口端口（圖2和圖3）。一些制造商提供的組織培養(yǎng)室是專為這個物鏡。
如圖2所示，激光光束首先進入一個聚焦透鏡傾斜放置在顯微鏡載物臺。鏡頭的物鏡是將激光照射在幾乎相同的方式，作為一個物鏡在EPI照明，但鏡頭也更容易對準(zhǔn)的窄波束寬度。透鏡的焦距是不重要的，50和100毫米之間的范圍，但應(yīng)允許研究者很容易改變照明面積的大小在一個狹窄的范圍內(nèi)。在照明系統(tǒng)其他組件，聚焦透鏡應(yīng)安裝在一個軸與入射激光束方向?qū)?zhǔn)X-Y-Z翻譯。譯者可以安裝在實驗室的工作臺上或顯微鏡的階段，但會更容易使當(dāng)它被安裝在舞臺上。
三個主要的光學(xué)元件和直接控制激光束的大小和途徑進入聚焦透鏡之前（見圖1）。這些包括擴束器拓寬激光光束在退出腔，一個分束器（可選）或反射鏡，和一個光束導(dǎo)演將光束聚焦到聚焦透鏡。
激光光束擴展器的廣泛可用一些經(jīng)銷商，并用于在聚焦透鏡的光束寬度控制。作為一個結(jié)果，然后通過聚焦透鏡確定收斂到樣品與焦斑寬度角。激光光折射在一系列的光束角遇到的立方體的垂直面時。由此產(chǎn)生的幾何畸變的界面處產(chǎn)生一個橢圓的照射區(qū)域，這是拉長時相比，一個高斯分布的平行光束的預(yù)期模式。梁是更大的當(dāng)他們進入聚焦透鏡產(chǎn)生具有較薄的尺寸反射點。在最佳條件下，梁的半寬度接近下限可以達到2.5μm。
分束器是一面鏡子，把水平激光束在垂直方向（90度角）來提升它的過去的高度的顯微鏡載物臺和玻璃棱鏡或塊。一個可調(diào)節(jié)的光學(xué)安裝應(yīng)該用來房子分束器可移除以允許激光直接進入一個快速和可逆轉(zhuǎn)換為輔助外延照明顯微鏡端口。利用部分鍍銀鏡或甚至一個普通的載玻片作為分束器，兩個落射照明和全內(nèi)反射可以同時查看。
梁主任鏡采用角的激光束從垂直方向斜向聚焦透鏡（見圖1）。鏡子高度在全內(nèi)反射面確定入射角。除了線性調(diào)節(jié)高度，導(dǎo)演鏡子應(yīng)該裝在一個雙軸旋轉(zhuǎn)安裝允許的未聚焦的激光束方向進入棱鏡。如果鏡像安裝連接到移動臺顯微鏡階段（而不是實驗室），的反射區(qū)的位置可以被聚焦時，試樣的變化不敏感。
正確對齊時，準(zhǔn)直和聚焦的激光束進入玻璃立方體，而導(dǎo)演折射罷工的全內(nèi)反射界面（在立方體的下表面）與入射角超過臨界最小。無論是規(guī)模還是的立方體形狀是至關(guān)重要的，和棱鏡或長方形的玻璃塊可以很容易地取代。等邊45-45-90-degree棱鏡是標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)項目，可以從各種來源購買。一個平頂棱鏡（圖2和圖4），如立方體上面或截斷的三角形，使鹵鎢燈和聚光系統(tǒng)在棱鏡安置。在這種結(jié)構(gòu)中，傳統(tǒng)照明技術(shù)如明場，暗場，相襯，和微分干涉對比可以耦合TIRFM調(diào)查協(xié)助確定的熒光源于界面的空間位置。
安裝的棱鏡或玻璃塊，將一滴純甘油或浸油的文化室的上表面和棱鏡慢慢降低到油面，從而傳播的液滴成薄薄的一層。接觸媒體（甘油或油）有兩個物鏡：保證棱鏡和樣品室之間的光學(xué)接觸，和機械潤滑區(qū)的兩個玻璃表面之間。隨著標(biāo)本室側(cè)翻譯在掃描過程中，棱鏡或玻璃塊是固定的。入射的激光束傳播通過棱鏡的斜下方，然后通過甘油或油層，最后通過試樣，完全反映在基板的底面直接在顯微鏡的光軸。基板的厚度是不重要的，除了厚的基板（那些接近一個毫米甚至更多）可能會限制激光束從會議的底面直接在顯微鏡的光學(xué)軸。
浸泡接觸的介質(zhì)（油或甘油）應(yīng)謹慎使用，因為任何多余的可能積聚在棱鏡的下邊緣和干擾入射激光照明時，首先進入玻璃。棱鏡的大小并不重要，但是大棱鏡可以抑制試樣的橫向運動，雖然會增加浸泡介質(zhì)珠和入射光束之間的間隙。一般來說，一個棱鏡或玻璃塊與約一平方厘米面積是理想的。
棱鏡采用幾個令人興奮的激光系統(tǒng)不需要在折射率精確匹配的幻燈片或蓋玻片中發(fā)生全內(nèi)反射。他們可能與甘油，環(huán)己醇的光耦合，或顯微鏡浸油，其他光不同的液體。浸沒油具有較高的折射率，這有助于避免在棱鏡/耦合在低入射角的媒體接口可能全內(nèi)反射。然而，許多品牌的浸油表明自體熒光顯著量。另外重要的一點是，截斷棱鏡表面不需要特殊的拋光處理，但與一個標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)顯微鏡載玻片平滑充分履行。
幾個樣品室的設(shè)計，利用由玻璃和/或蓋玻片窗口如圖3所示。左側(cè)（圖3（a））是一個塔姆室內(nèi)設(shè)計提供一種薄的輪廓，使組織培養(yǎng)的細胞是通過一層薄的緩沖溶液中觀察到的，它允許高數(shù)值孔徑的物鏡有很短的焦距的使用。一個單層的細胞上生長，蓋玻片（或顯微鏡），是從一個具有厚度小于100微米的薄墊片下蓋玻片分離。接入孔，使細胞與各種各樣的溶液進行滴定灌流，平衡結(jié)合實驗，或在細胞表面相互作用的動力學(xué)分析。一個類似的裝置，該德沃夏克史托勒控制的環(huán)境中培養(yǎng)室，是說明了在圖4（b）。該室還利用蓋玻片兩個頂部和底部的窗口，但不能訪問孔或任何機制來允許添加化學(xué)品或緩沖溶液的變化。
如圖3所示，標(biāo)本室包含必要的維持培養(yǎng)細胞的水性緩沖液。這個解決方案是夾在襯底表面和蓋玻片之間，相隔一氯丁橡膠或聚四氟乙烯墊片。聚四氟乙烯環(huán)是市售的，具有的厚度范圍從50微米以上。緩沖溶液的深度必須相當(dāng)薄，如果高放大倍率的物鏡具有大的數(shù)值孔徑和短的工作距離是被雇用。在許多情況下，該玻璃棱鏡在基板上的向下的壓力可能是適當(dāng)?shù)拿芊鈽悠肥覠o附加卡，但許多室內(nèi)設(shè)計（圖3）包括安全機制的基板和玻璃蓋玻片。
在情況下，一個棱鏡法（而不是一塊玻璃）實現(xiàn)全內(nèi)反射（見圖4（a）），最大入射角是通過引入激光束從水平方向上得到的。標(biāo)準(zhǔn)玻璃（有1.52個折射率），最大入射角為73度的直角棱鏡和79度的等邊棱鏡。由于三角棱鏡上表面不平坦的相位對比度和其他的透射光技術(shù)不采用這種結(jié)構(gòu)兼容。然而，自定義截斷和棱鏡的頂拋光（顯示如圖4一個選項（A））產(chǎn)生的表面，可以很容易地通過入射的光從上面通過倒置顯微鏡聚光系統(tǒng)。
安裝在顯微鏡聚光鏡單元時，一個60度的梯形棱鏡（圖4（b））是最方便和可重復(fù)配置開發(fā)的TIRFM以上倒儀器階段。入射的激光束是垂直的，所以全內(nèi)反射面積變化的橫向一個很小的程度時，棱鏡提高和relowered在試樣的變化。此外，傳統(tǒng)的透射光技術(shù)（相對比，明暗，等）與本實驗設(shè)計兼容。由于入射角固定為60度（1.52，普通光學(xué)玻璃的折射率）是不能夠支持全內(nèi)反射，并具有高折射率棱鏡是必需的。用燧石玻璃制成的棱鏡（折射率為1.64）將符合這些要求，與市售。光束將折射遠離正常的從通過棱鏡到蓋玻片的69度的角度，從而超過臨界角在蓋玻片/緩沖或蓋玻片/細胞界面。與墻為45和60度之間的梯形是理想的，但這些單位是不容易的，必須生產(chǎn)出定制規(guī)格。不幸的是，45或60度的梯形也沒有市售，但他們可以通過截斷和拋光的市售的三角棱鏡的頂點的廉價生產(chǎn)。
圖5給出了四分之一的結(jié)構(gòu)利用一個拋物面反射鏡和半球形棱鏡進行倒置顯微鏡實驗。在本設(shè)計中，反射鏡和棱鏡的位置使激光束穿過一個半徑的棱鏡對全內(nèi)反射靶區(qū)在凹面鏡的焦點。因為光線進入棱鏡幾乎正常在所有的入射角在臉上，光束輪廓的像差相比，與一個立方體或矩形棱柱塊所觀察到的減少。在垂直入射激光束的橫向偏移能總是把焦點放在同一個地方，使大量的、方便的改變光線入射角。此外，在漸逝場的干涉條紋，可以通過將輸入光束分成兩個組件創(chuàng)建的，每個反射在拋物線一個單獨的方位角位置，但重組在拋物面焦點。條紋間距可以通過調(diào)整兩個入射光束的相對方位角位置的變化，和非常高的空間頻率可以達到。干涉條紋，可以作為一種輔助聚焦的接口上創(chuàng)建一個平行線的干涉條紋圖案。這一模式可以在細胞/襯底接觸的區(qū)域觀察到的，這證實了激勵源的倏逝場（而不是通過細胞場隨機散射光）。干擾模式也是有用的在表面的擴散速率的研究來衡量的接觸區(qū)域的膜元件的橫向流動。盡管這個設(shè)計的通用性（圖5），定位是非常困難的，該系統(tǒng)是更敏感的振動。
倒置顯微鏡結(jié)構(gòu)審查這里都有一些優(yōu)點和缺點。主要的優(yōu)點是能夠利用而廉價的光學(xué)顯微鏡工作臺上有足夠的空間位置的試樣和玻璃塊/棱鏡和支撐光學(xué)元件。此外，棱鏡可以安裝在聚光鏡支架（安置在現(xiàn)代倒置顯微鏡階段）在升降自如，并與傳統(tǒng)的光學(xué)技術(shù)輔助觀察。最后，這些光學(xué)安排享受簡單設(shè)計和最容易對準(zhǔn)的全內(nèi)反射系統(tǒng)。
倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)主要缺點之一是事實，標(biāo)本不易從上面和常規(guī)照明由棱鏡先端阻礙訪問。同時，最短的工作距離的物鏡不可能達到聚焦在緩沖層，并具有高數(shù)值孔徑的物鏡圖像質(zhì)量的降低由于球面像差時，觀察樣品在較厚的緩沖層。
棱鏡或玻璃塊對齊的倒置顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)涉及到對全內(nèi)反射區(qū)直接在物鏡而試樣在焦點。第一步是將樣品室和棱鏡組合，然后將試件在使用明場照明的重點（甚至在棱鏡的頂點是存在的）。接下來，用激光聚焦透鏡的光束直接刪除，以便它經(jīng)過的物鏡前透鏡中心的全內(nèi)反射。這可以通過直接觀察（不通過顯微鏡目鏡）用于散射入射光在棱鏡，浸層，和基板。重新插入聚焦透鏡后聚焦的激光束，使進入棱鏡側(cè)面大約一毫米的底部邊緣以上調(diào)整其位置。直接觀看梁應(yīng)在棱鏡底部顯示的散射光三共線性點：兩個在外面，光束通過浸漬層，和一個中央地方的光束經(jīng)過在試樣內(nèi)部全反射。聚焦透鏡應(yīng)調(diào)整中間點是可見的細長圓柱面。和全內(nèi)反射區(qū)域大小的位置可以用聚焦透鏡的翻譯和移動透鏡的縱向優(yōu)化照明區(qū)域的尺寸調(diào)整。
的全內(nèi)反射區(qū)的形狀依賴的棱鏡或玻璃塊側(cè)表面的取向，在激光束進入。如果一邊是垂直的（如在一塊或矩形），該地區(qū)將長到一定程度，是一個電子束會聚功能。正如前面所討論的，延伸率是由于像差的大折射角度首先介紹了棱鏡表面或玻璃塊。另一方面，如果側(cè)面傾斜使準(zhǔn)直的激光束進入一個角度接近垂直，然后反射區(qū)會像一個小的細長的圓錐形部分，預(yù)計從切片的圓柱形束在一個角。
在所有上述的光學(xué)結(jié)構(gòu)，照亮的區(qū)域?qū)⒈３制椒€(wěn)的視場中心作為試樣在橫向尺寸掃描。然而，當(dāng)顯微鏡階段期間移動焦點，照亮的區(qū)域可以橫向移動作為樣本集中，取決于是否聚焦透鏡和光束的導(dǎo)演都安裝在實驗室的工作臺上或顯微鏡階段。
全內(nèi)反射點的重點應(yīng)不大于視場寬度。如果現(xiàn)場太大，假散射和離焦熒光從棱鏡和蓋玻片之間的浸油層會增加其他熒光背景低，可能與全內(nèi)反射熒光顯微鏡。另一個工件時的入射角非常接近臨界最小，表現(xiàn)為沿界面的表面細胞明顯的陰影。這可以通過一定的入射角超過臨界角數(shù)度，避免。
當(dāng)入射角接近臨界值，有時很難確定是否已經(jīng)實現(xiàn)了全內(nèi)反射。在這種情況下，通過顯微鏡目鏡觀察熒光強度?？蓭椭芯空叽_定儀器的正確結(jié)構(gòu)。從TIRF界面熒光發(fā)射是從由入射光束在亞臨界“略讀”的角度通過緩沖水傳播的激發(fā)截然不同。因為倏逝波（不像光束傳播）是遠小于的重點物鏡深度，熒光似乎來源于由全內(nèi)反射的激發(fā)單平面。相反，落射照明（從亞臨界梁）激發(fā)熒光團在標(biāo)本室和二次熒光大部分是在很寬的范圍內(nèi)的焦平面的觀察。
局部定性強度測量在總的內(nèi)部反射的實驗，這可能是可取的限制區(qū)，從收集的發(fā)射光。經(jīng)常被照射區(qū)域是不可能很小，但確定的表面積可以通過一個可調(diào)光闌放置在發(fā)射光通路的圖像平面上獲得。
另外幾個TIRFM結(jié)構(gòu)涉及倒置顯微鏡已被聘用的人員。該系統(tǒng)如圖6所示提供了另一個系統(tǒng)，固定棱鏡相對于試樣代替激光束。雷射光從右邊進入通過一個入口的棱鏡，并折射到基板上傳播朝向顯微鏡光軸通過多次內(nèi)部反射。一路上，多重反射光束遇到標(biāo)本（組織培養(yǎng)細胞粘附在玻璃蓋玻片）說明了發(fā)色團在玻璃/緩沖界面區(qū)。通過試件和基板后，反射光束進入射棱鏡，它將光從實驗。在這種結(jié)構(gòu)中，光照反射區(qū)將試樣時，翻譯。
一個更有用的結(jié)構(gòu)，是兼容的同時注射或膜片鉗實驗，如圖7所示。為了提供從上面一個組織文化沐浴在緩沖容易和連續(xù)訪問，棱鏡是部署下階段接觸玻璃基板。這種結(jié)構(gòu)，不可用于所有倒置顯微鏡，受到嚴密的幾何因為物鏡也居住在鄰近地區(qū)。如系統(tǒng)如圖6所示，臺下的棱鏡啟動多個總的內(nèi)部反射在蓋玻片，這將激勵光波導(dǎo)的遠軸的視場的中心。
在最簡單的形式中，一個小三角棱鏡（商用）放置，通過浸泡油或甘油，與含有細胞和緩沖液蓋底光接觸。樣品可以翻譯而棱鏡保持橫向固定，雖然涂抹油可以在蓋玻片可以摧毀第一反射下側(cè)左（實驗）。一個可行的方法是使用一個額外的干預(yù)蓋玻片與光學(xué)透明膠固定到棱鏡。滑動運動發(fā)生的干預(yù)和細胞的蓋玻片蓋玻片之間，這是光學(xué)接觸，由一層薄薄的潤滑油或甘油浸泡。這種結(jié)構(gòu)的一個主要缺點是，油或甘油浸漬物鏡無法使用，因為浸泡介質(zhì)可能會破壞內(nèi)部反射照明斑的形成之前。然而，空氣（干）或水浸的物鏡很好地工作在這種情況下。
直立顯微鏡結(jié)構(gòu)
梯形棱鏡，類似于圖4所示（B），可以安裝在聚光鏡支架在直立顯微鏡在位于階段標(biāo)本全內(nèi)反射界面觀察現(xiàn)象（圖8）。擴展的激光束被引入到顯微鏡基地使用用于發(fā)射光源相同的端口（這應(yīng)該被刪除）。一個長的焦距（約250毫米）會聚透鏡放在門口附近的港口和安裝在X-Y翻譯用于聚焦入射激光束和允許的橫向位置微調(diào)。激光準(zhǔn)直照明可以利用顯微鏡內(nèi)置的光學(xué)列車直梁通過底座和垂直向上進入棱鏡。一個額外的鏡頭位置略高于顯微鏡基礎(chǔ)往往是翻譯和焦點的全內(nèi)反射點有用的。這種結(jié)構(gòu)不調(diào)整入射角提供了很大的靈活性，但有限的范圍內(nèi)的值可以通過使用具有不同的角的幾何形狀和折射率達到幾個梯形。圖像是通過冷卻科學(xué)CCD數(shù)碼相機在圖5所示的收集，但一個光電倍增管或雪崩光電二極管可以很容易地取代。
棱鏡玻璃折射率的選擇是有限的要求，用火石玻璃（折射率為1.62）是優(yōu)選的配方。一個60度的入射角，棱鏡的折射率必須至少1.53為全內(nèi)反射發(fā)生在玻璃/水界面（無論基板材料）。這就是為什么火石玻璃，而不是普通的光（皇冠）玻璃或石英，是這些實驗的理想的棱鏡材料。
照明光被反射到棱鏡的顯微鏡鏡下，并透過玻璃折射棱鏡的角邊。因為梯形棱鏡將自定義尺寸沒有市售，菱形截面是由截斷和拋光觸手可及的等邊三角形的棱鏡上制作。聚焦透鏡后的激光軌跡定位，這是調(diào)整的傾斜側(cè)和朝向的上表面在60度的入射角進入棱鏡中心在全內(nèi)反射的底部。當(dāng)聚焦透鏡插入光路，光束遵循相同的過程，但更薄、更強烈的。
標(biāo)本室，這可能是一個塑料培養(yǎng)皿或培養(yǎng)皿，置于顯微鏡下觀察期。一小滴浸介質(zhì)（甘油或油）放置在棱鏡上，并由聚光器齒條機構(gòu)提高帶來的文化室的下表面的光學(xué)接觸。然后是激光束的聚焦透鏡位置譯者調(diào)整內(nèi)部全反射在燃燒室的上表面（或基片）和遵循一個對稱的過程返回在棱鏡對面鏡座。此設(shè)置適用于許多類型的基板，但特別適合觀察細胞在塑料培養(yǎng)皿底部生長。然后，細胞可以被視為在該室最初被播種后沒有重新安裝步驟。在一個直立顯微鏡觀察試樣使研究者同時探測細胞微量移液器，片夾，和注射器，提供物鏡有足夠的工作距離。
二次熒光發(fā)射可以通過干燥，收油，或水浸物鏡（調(diào)遷后的大部分緩沖）通過蓋玻片，懸浮的細胞單層表面上方間隔。另外，一個傾斜的錐水浸物鏡可以直接放置到緩沖溶液浸泡的細胞。直立顯微鏡結(jié)構(gòu)是非常方便的，因為樣品可以互換，因為他們很容易與標(biāo)準(zhǔn)照明系統(tǒng)。的TIRF照明區(qū)域的位置也通過固定和不受影響的，即使在移動臺顯微鏡，占絕大多數(shù)的現(xiàn)代正立顯微鏡設(shè)計。主要的缺點是沒有切換到另一個棱鏡具有不同的傾斜角度的入射光角度不可調(diào)。
一個直立的系統(tǒng)提供了高質(zhì)量的圖像水浸時的物鏡是潛到直接通過發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿或培養(yǎng)室的緩沖溶液中圖像的細胞，但結(jié)構(gòu)是否存在幾個缺點。許多用于培養(yǎng)容器結(jié)構(gòu)的聚合物制劑有一定程度的熒光，這可能會降低弱熒光樣品的對比。這種效應(yīng)可以復(fù)合如果浸耦合介質(zhì)不慎重選擇。浸泡油的幾個商業(yè)品牌也顯示熒光在不同層次，調(diào)查員警告檢查浸入油和塑料培養(yǎng)器皿潛在的熒光效應(yīng)在使用它們之前的TIRFM實驗。不同品牌的組織培養(yǎng)塑料在顯示在激發(fā)自體熒光的量有顯著的變化。
棱鏡，滑動窗口和蓋玻片，室，可以在大多數(shù)應(yīng)用普通火石光學(xué)玻璃制成的，除非短穿透深度從高折射率產(chǎn)生所需的。光學(xué)玻璃不透光的低于約310納米，也有一個較長的衰減時間，昏暗的光反射，可以在一些漂白實驗問題。高質(zhì)量的自發(fā)光的熔融二氧化硅（石英）要低得多。更奇特的高折射率的材料，如藍寶石，二氧化鈦，鈦酸鍶，不會受到高水平的熒光產(chǎn)量漸逝場的穿透深度超過比光波長低一個數(shù)量級。
熒光檢測
不同的共聚焦和多光子顯微鏡，許多TIRFM圖像可以被記錄在電影中的方式類似的顯微鏡，在很大程度上依賴攝影經(jīng)典形式（明場，暗場，微分干涉相襯，，等）。在某些情況下，尤其是當(dāng)只有幾個熒光標(biāo)本中存在的，最好是使用更敏感的成像設(shè)備，如強度增強的冷卻CCD攝像機，科學(xué)，雪崩光電二極管，或光電倍增管。時間推移cinemicrography也有可能在TIRFM實驗，和圖像幀序列可以與任何上述設(shè)備拍攝，其中選擇將取決于二次熒光強度和暴露時間獲取圖像。豐富的熒光樣品可以記錄在膠片上（或單獨一幀序列），但圖像采集與視頻或CCD攝像機是目前硬件現(xiàn)成的調(diào)查人員更方便。
通用性大量時提供的圖像獲取與光電倍增管或雪崩光電二極管。光電倍增管通常采用空間懸而未決但快速檢測和熒光強度的定量分析。可變孔和/或圖像平面膜片（以上）使研究者可以選擇性地捕獲的完全可用字段的部分。這是有用的當(dāng)長的采樣間隔在低光照水平是必要的，或只有部分的視場的興趣。光電倍增管的光譜特性，應(yīng)當(dāng)選擇一個圖像采集裝置的考慮，這些應(yīng)該被檢查的熒光團的發(fā)射特性一致。
結(jié)論
在一般情況下，全內(nèi)反射更難在顯微鏡由于激光束的焦點調(diào)整需要調(diào)整到顯微鏡的焦平面與光軸移動階段已經(jīng)實現(xiàn)。當(dāng)選擇一個顯微鏡技術(shù)研究，注重機械穩(wěn)定性和樂器的結(jié)構(gòu)基序。倒置或直立顯微鏡在隔離表一個沉重的框架將使研究者建立脆弱的漸逝場的相對振動自由的環(huán)境。聚焦激光照射源保持在幾微米的范圍內(nèi)長時間是困難的（最好的），但可以通過當(dāng)顯微鏡，激光光源，并支持光學(xué)元件固定在適當(dāng)?shù)陌惭b和牢固地固定在工作臺或顯微鏡階段。
廣泛的顯微鏡物鏡的設(shè)計與實驗兼容技術(shù)。唯一的絕對的要求是，物鏡有足夠長的工作距離觀察接口在緩沖溶液的墊片厚度薄差距的定義。聚四氟乙烯和氯丁橡膠墊片可以比任何標(biāo)準(zhǔn)的物鏡工作距離較薄，同時仍然比漸逝場的穿透深度大得多。這減少了無法專注于接口的可能性，但并不能彌補潛在的畸變，在樣品/緩沖區(qū)的折射率變化引起的。在大多數(shù)高放大倍率的物鏡的球面像差校正的關(guān)鍵取決于試樣被立即在蓋玻片的遠側(cè)，而不是在一個額外的薄水層。結(jié)果可以是一個圖像對比度不足，產(chǎn)生朦朧的形象甚至當(dāng)銳聚焦。物鏡規(guī)范沒有一般的規(guī)則可以提供，但水浸的物鏡（或浸漬或那些需要蓋玻片）可能是最好的（也是最貴）的選擇。另一方面，TIRFM實驗已經(jīng)成功地進行了與幾乎所有市售的數(shù)值孔徑和放大的物鏡。
在許多研究，它是理想的快速開關(guān)的照明之間的界面的全內(nèi)反射和更深入地滲透到試樣的體積由經(jīng)典的落射熒光照明。作為一個例子，一個短暫的過程中可能涉及的同時，但有些不同，在膜和細胞質(zhì)的變化，兩者都必須被記錄。專門設(shè)計的光電系統(tǒng)，利用聲光調(diào)制器由若干研究已經(jīng)描述了。這些結(jié)構(gòu)是由電腦控制的，通常包含多個調(diào)制器的行為同步振蕩TIRF和落射熒光寬視野之間的亮度，同時采集數(shù)據(jù)與光電倍增管和快速響應(yīng)的光電二極管裝置。
玻璃表面支持細胞的粘附性往往是涂有特定的基板技術(shù)研究。的二氧化硅的表面化學(xué)衍生物可以產(chǎn)生獨特的物理和化學(xué)吸收特性，在調(diào)節(jié)模型膜和類似結(jié)構(gòu)的形成是有用的。此外，某些特定的化學(xué)共價結(jié)合在細胞生物學(xué)和生物物理學(xué)是特別有用的。細胞粘附可通過附件的多聚賴氨酸對玻璃表面增強，和疏水性的表面可以長鏈碳氫化合物的脂質(zhì)單層吸收了。其他有用的分子，可用于治療表面選擇性特異性包括抗體，抗原，平面的磷脂，和外源凝集素。
層鋁薄（20納米的區(qū)域），它可以淬滅熒光，也可以應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)的真空蒸發(fā)玻璃表面。沉積厚度可以通過完全蒸發(fā)前測鋁量的精確控制。沉積后，鋁膜的上表面自然氧化物在大氣中產(chǎn)生一層薄薄的鋁氧化物。氧化物涂層膜具有相似的二氧化硅的化學(xué)性質(zhì)，可以衍生的在一個類似于玻璃的方法。一種金屬膜幾乎完全淬火的熒光團的熒光在約10納米的能力允許從標(biāo)記的蛋白質(zhì)的非特異性吸附到襯底的信號抑制。這發(fā)生在允許從更遙遠的標(biāo)記的蛋白質(zhì)吸附到附著膜熒光。
不同的共聚焦顯微鏡的光學(xué)部分，產(chǎn)生排斥的焦點發(fā)出的光與一組的圖像平面針孔光闌，TIRFM是有限的地區(qū)在幾百納米的玻璃/緩沖界面的全內(nèi)反射的發(fā)生。激光共聚焦顯微鏡具有通用性明顯的優(yōu)勢，因為光學(xué)切片的作品在任何平面的試樣并不僅限于不同的折射率之間的接口。然而，TIRFM確實有幾個優(yōu)點包括一個非常薄的光學(xué)部分（約100納米和600納米的共焦），相鄰的界面附近區(qū)域選擇性的照明，并有能力（相對便宜的）適應(yīng)現(xiàn)有的顯微鏡利用技術(shù)。
