奧林巴斯顯微鏡信號噪聲的注意事項

 光學(xué)理論提供分辨率顯微鏡是由光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑和用于形成圖像的光的波長。為了在實踐中是有意義的，然而，分辨率必須從對比度的定義，并從標(biāo)本，最終確定信號的電平的測量不確定度的收集的光子數(shù)，因此，可以實現(xiàn)圖像的對比度。在激光掃描共焦顯微術(shù)，特別是在生物材料，信號電平通常是低，由于在聚焦光束從小型熒光探針體積光獲得數(shù)量有限。

典型的共聚焦和寬視場顯微鏡的數(shù)字圖像的具有不同程度的信號電平的比較示于圖用小針孔孔徑在共聚焦顯微鏡產(chǎn)生的圖像采集一薄的光學(xué)部分具有高對比度和相對低的信號 - 噪聲比時大量的熒光標(biāo)記的情況下（圖1（a），在樣本為小鼠腎臟的三重標(biāo)記薄膜部）。然而，在較低的探針濃度，光強(qiáng)度快速下降，將所得的共焦圖象，由于信號電平低（圖1（b）），看起來更粗糙。試樣在圖1所示的寬視場熒光圖像（a）和圖1（b）中包括（圖1（c）），以表明降解從區(qū)域遠(yuǎn)離物鏡焦平面產(chǎn)生熒光的問題。

在利用數(shù)字顯微鏡技術(shù)，包括共焦方法中，信號采樣對的效果對比和分辨率成像能力的任何定量評估必須加以考慮。所測量的信號電平值不直接代表由標(biāo)本發(fā)出或散射光子的數(shù)量，但是成比例的數(shù)量。另外，信號強(qiáng)度的每個單獨樣品是只收集光子的數(shù)目的近似，并且會隨重復(fù)測量的變化，被稱為噪聲，賦予強(qiáng)度的定量化的不確定性，因此在圖像數(shù)據(jù)的對比度和分辨率。盡管采樣的影響可以相當(dāng)容易地估計，在一個單一的像素噪聲的確定是更加成問題的。

在透射或反射的對比機(jī)制，檢體的信號強(qiáng)度（光子數(shù)）通常是非常高的，并且主要噪聲源是電子噪聲的儀器，或者在某些情況下，在照明強(qiáng)度的波動。當(dāng)熒光發(fā)射被用于成像的光子數(shù)目通常非常小，并且在檢測到的光子，或泊松噪聲的數(shù)量的統(tǒng)計變化，將成為最顯著變量。圖2示出噪聲的增加的不確定性所采樣的強(qiáng)度值在從成像2點狀試樣的特性所造成的艾里圖案的效果。

而不是用一個噪聲和圖像特性的影響的數(shù)學(xué)評估開始，它是考慮在概念上的噪聲和有用的機(jī)制信噪比影響成像。在強(qiáng)度測定的不確定性，并基于強(qiáng)度測量值的對比，在對比度降低的結(jié)果。任何對比度降低，降低的截止距離，退化的分辨率（相對于一個給定的對比度）在檢測到的信號從噪聲的結(jié)果。它相對于信號噪聲水平影響成像能力，可以在一個單獨的圖像的像素區(qū)分灰度級的數(shù)目進(jìn)一步的機(jī)制，這實際上建立在圖像動態(tài)范圍的限制。有效的動態(tài)范圍可以被認(rèn)為是信號的比率除以噪聲。由于噪聲，由于其在熒光顯微鏡下泊松特性，相當(dāng)于平均信號的平方根，動態(tài)范圍信號劃分為信號的平方根，因此是相當(dāng)于信號的平方根。

當(dāng)噪聲樣本信號的貢獻(xiàn)是，它本質(zhì)上提高信號電平“地板”，下面的對比不足存在樣本點特征之間使他們能夠作為獨立的。在繪制對比距離函數(shù)顯示分辨率的限制，一般忽略噪聲和承擔(dān)無限高的信噪比和動態(tài)范圍。間距要求提供足夠的對比度來“解決”兩個圖像特征的噪聲被認(rèn)為是增加時，所需的能見度和對比水平必須到一個更高的對比度水平確定最小可用。當(dāng)使用對比范圍不再延伸到零的情況，如圖3所示的存在，在一個恒定的任意噪聲限制使用對比點分離范圍。

采取的提高通過減少在試樣上的焦斑尺寸的決議將導(dǎo)致在激發(fā)熒光團(tuán)的數(shù)量減少，因此在光子可以收集數(shù)的步驟，這意味著更高的噪聲電平。在噪聲的相對信號和動態(tài)范圍的極限分辨率的提高，可以通過減少強(qiáng)度的點擴(kuò)散函數(shù)的尺寸達(dá)到減少增加（PSF在共聚焦顯微鏡）。當(dāng)觀察體積減小的點擴(kuò)散函數(shù)小，采樣周期必須增加以保持相同的信噪比，一種策略，往往不是由于同時增加光子通量在標(biāo)本完整性的有害影響，熒光飽和度選項。

與探測器針孔是無窮小的只有嚴(yán)格獲得共焦成像的影響，產(chǎn)生的圖像信號電平太低是有用的。在另一個極端，一個非常大的針孔選擇最大化樣本信號將消除聚焦優(yōu)勢完全。在實踐中，一個最佳的針孔大小必須選擇最大的標(biāo)本信息的記錄，并考慮到顯微鏡配置，其運作模式，和試樣的特性。

如前所述，在生物熒光顯微鏡應(yīng)用的整體信號的水平通常是低的幾個原因，其中之一是熒光光漂白后的照明是一個因素，必須通過限制激發(fā)光總暴露最小化。這有效地限制了可用于檢測的光子數(shù)的增加，對檢測過程的統(tǒng)計性質(zhì)引起的信號變化的意義。這種噪聲通常被稱為散粒噪聲或光子噪聲是由于光的粒子性和發(fā)射光子的離散的電特性。實際上，在檢測器中的光子到達(dá)時間的隨機(jī)波動是負(fù)責(zé)的散粒噪聲。在低信號電平，噪聲降低，可以在一個圖像的歧視和對圖像質(zhì)量有一個整體的降解效果的灰度級的數(shù)目。

當(dāng)所有的噪聲源被認(rèn)為是，信噪比（S / N）可以被用來作為衡量的整體圖像質(zhì)量。如果噪聲是唯一顯著的噪聲分量的檢測信號在激光共聚焦顯微鏡，信噪比會隨著針孔大小的直接增加，使價值得到提高在這一點上針孔的直徑變得過大，達(dá)到理想的共焦光學(xué)切片的影響。這是沒有的情況下，然而，和一個額外的統(tǒng)計噪聲源的背景熒光源自外部利益的平面熒光和從試樣的熒光和光學(xué)元件介紹（包括透鏡水泥），這兩個限制相對于背景的特征對比試樣。

由于樣本特征不相關(guān)的背景信號的信噪比下降，實際上非常大的針孔大?。ɑ蛟谝粋€針孔缺失）。在理論上理想的聚焦裝置，信號背景（S / B）比最大時，探測器的針孔孔徑直徑有零。因為這樣的一種孔徑會排除信號及背景，然而，它沒有實際應(yīng)用。在一個有用的顯微鏡，孔徑大小必須增加，以提高信噪比。在一般情況下，一個最佳的孔徑尺寸存在的最大信噪比，同時保持足夠的圖像對比度好的信號背景比。

增加在試樣入射激光功率是另一種機(jī)制，可以用來增加的信號電平，并提高信噪比。然而在實踐中，這一策略，通過任何改善的現(xiàn)象有限公司簡稱熒光飽和，其熒光發(fā)射強(qiáng)度達(dá)到最大值，不額外增加激光功率輸入。這種非線性響應(yīng)的結(jié)果利用激光照射強(qiáng)烈的熒光分子往往數(shù)量有限的很大一部分被提升到激發(fā)態(tài)（人口減少地面狀態(tài)）。效果是降低明顯的熒光團(tuán)的濃度，以及由此產(chǎn)生的不可預(yù)知的熒光基團(tuán)的濃度和排放強(qiáng)度之間的關(guān)系復(fù)雜數(shù)據(jù)的解釋。因此，熒光信號可通過漂白或飽和度的限制，在信噪比大大不同的相對影響，并與不同的限制的各種顯微結(jié)構(gòu)的性能。

由于漂白或飽和信號強(qiáng)度的限制是熒光顯微鏡在生物材料進(jìn)行特別是至關(guān)重要的，這是最常見的應(yīng)用共聚焦儀器。負(fù)責(zé)公司發(fā)射信號的現(xiàn)象是曝光過度的時間和/或強(qiáng)度有關(guān)。與其他的對比度增強(qiáng)利用反射或透射光的結(jié)合或免疫金標(biāo)記染色的機(jī)制或方法，利用相位對比差異，在試件破壞是一種可能性，激光強(qiáng)度存在類似的限制。然而，漂白是在非熒光技術(shù)的一個因素，并沒有限制對信號的采集，在很長一段時間如果加熱或其他長期光照不破壞試樣。

因為顯微鏡的分辨率是離不開的對比，和對比度是依賴于信號的信噪比，對試件的功能可見性所需要的閾值對比最終是有限的由檢測到的光子數(shù)。與典型的熒光顯微鏡光子數(shù)量有限，衍射極限分辨率不實用的儀器操作來實現(xiàn)的，它是必不可少的，光子的數(shù)量是由成像序列的每元優(yōu)化最大化。相對于在共焦成像信號的噪聲，散粒噪聲，或光子噪聲，是因為它帶來了根本的限制信號的信噪比，最重要的。在從信號的光子的到達(dá)特性的波動相關(guān)的散粒噪聲是外部的探測器本身并不能減少。波動的背景光子到達(dá)的貢獻(xiàn)（背景噪聲）可以減少，這是通過限制檢測器的背景信號接受最常見的實現(xiàn)。

在檢測到的光子信號本身的統(tǒng)計變化是由一個泊松分布函數(shù)，它趨向于正態(tài)分布在足夠大的數(shù)量的光子的參與。這樣的分布，它的平均值等于其方差的性質(zhì)。因為拍攝的噪聲方差的平方根，一個信號組成的N光子，信噪比是由：

在一個理想的顯微鏡，只有光散粒噪聲限制的圖像質(zhì)量。如果沒有背景信號存在，信噪比是一個簡單的方式進(jìn)行評估，由上式說明。在一個實際的顯微鏡，背景噪聲的存在也必須考慮加在信號和噪聲的噪聲分量之間的關(guān)系。如果信號背景比大，幾乎所有檢測到的光子代表圖像信息，和信噪比接近的值由給定的方程表示。如果背景貢獻(xiàn)大（小信號背景比），所需的信號可能會丟失在高背景噪聲，使信噪比接近零。對比情況如圖4所示，其中計算的圖像的強(qiáng)度分布的點源，提出了兩種不同的恒定的背景信號電平。圖4（a），背景強(qiáng)度相等的點源強(qiáng)度（以上）導(dǎo)致1的信號背景比。與背景水平高125倍，由圖4所示的強(qiáng)度分布（B），所產(chǎn)生的圖像不允許從高背景點特征的歧視。

共聚焦顯微鏡的最佳操作需要試圖平衡利用在前面的檢測器的孔徑的相互矛盾的要求，這是負(fù)責(zé)傳授的共焦配置的有利方面，對信號的減少，孔徑也產(chǎn)生。有一個圓形的（針孔）孔直徑的增加，增加了總的信號電平，但減小軸向分辨率，這表明一些妥協(xié)的孔徑大小設(shè)置是可取的。當(dāng)熒光技術(shù)的采用，弱信號的水平是實現(xiàn)最佳的圖像質(zhì)量有明顯的局限性。雖然多通道掃描和圖像的平均技術(shù)可以彌補(bǔ)低信號電平，這種失敗的優(yōu)點是快速掃描系統(tǒng)，可應(yīng)用于動態(tài)過程的研究在生物。平均技術(shù)，另外一個缺點是，系統(tǒng)中的光學(xué)缺陷產(chǎn)生任何噪音，如耀斑和光學(xué)元件散射，提高隨著信號，從而增加亮度的圖像質(zhì)量不相稱的改善。

處理在共聚焦熒光顯微鏡配置過度的背景噪聲的實際的策略是減少為探測器的孔徑尺寸排除更多的背景噪聲，從而增加的信號背景和信噪比。隨著孔徑的直徑減小，然而，一個點達(dá)到信號還原變得比背景更顯著減少，與信噪比的降低。這是顯而易見的，因此，一個孔徑大小可以發(fā)現(xiàn)，最大限度地提高信噪比，并能對信號與背景之間的關(guān)系的基礎(chǔ)上確定的。光圈的大小被確定是關(guān)于圖像質(zhì)量最佳的可能不符合最大對比度和分辨率，但并最大限度地提高圖像中標(biāo)本信息。最大的成就，有用信號，進(jìn)行標(biāo)本信息，是優(yōu)化性能的基礎(chǔ)上，在熒光顯微鏡。

在共聚焦顯微鏡激光聚焦到樣品和分布的點擴(kuò)散函數(shù)。發(fā)射的熒光，被收集和傳送到圖像平面后再分布的光學(xué)系統(tǒng)的點擴(kuò)散函數(shù)，具有垂直強(qiáng)度分布如圖5所示，水平。的點擴(kuò)散函數(shù)的強(qiáng)度分布的寬度是指示性的顯微鏡的分辨率。縱向分辨率是一個光軸方向上的強(qiáng)度分布函數(shù)，而在焦點的點擴(kuò)散函數(shù)是常見的通風(fēng)方式，這決定了橫向分辨率。第一個零（最?。趶墓廨S的距離3.8無量綱單位發(fā)生，對應(yīng)于橫向分辨率瑞利判據(jù)。為了實現(xiàn)聚焦操作，所發(fā)射的光子通過允許只有那些通過在圖像平面在前面的檢測器的檢測孔通過空間濾波。最大的空間濾波和背景抑制發(fā)生（理論上）的孔半徑（R）等于零。作為R增加承認(rèn)可用光水平，共聚焦特性降低到，在大孔半徑，顯微鏡作為一個傳統(tǒng)的寬場儀。

一種光學(xué)系統(tǒng)的點擴(kuò)散函數(shù)的強(qiáng)度以絕對的尺寸取決于成像配置，并根據(jù)不同的放大倍率，照明的波長，光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑，和折射率介質(zhì)通過它的光的傳播。對于不同的顯微鏡和其他光學(xué)系統(tǒng)為代表的利用無量綱的成像特性，這是習(xí)慣光學(xué)單元是獨立的光學(xué)系統(tǒng)（例如，距離3.8單位從光軸的第一最小的通風(fēng)模式）。這些單位是由在橫向和縱向方向相關(guān)的特定的光學(xué)性能規(guī)范衍生的距離。橫向距離值的波長和數(shù)值孔徑，歸一化，同樣，縱向值歸一化波長，數(shù)值孔徑，和試樣的介質(zhì)的折射率。因為相對于光學(xué)性質(zhì)的成像性能評估的目的，是來代表變量如針孔大小的無量綱的光學(xué)單元，這些有用的，和一個獨立的儀器歸一化針孔半徑可以以這種方式定義。

橫向和縱向距離（V和U，分別）可以被歸一化的寬度和點擴(kuò)散函數(shù)的軸向尺寸，通過變換光學(xué)單元采用下列方程：

在這R從光軸的橫向距離代表，Z從焦平面的軸向距離，鈉數(shù)值孔徑，N代表的折射率，并在每個方程，K采用波長（λ）的關(guān)系：

為了與不同的探測器針孔大小的評價共聚焦儀器的性能，歸一化的針孔半徑V（D）可以從以前的方程如下，一個針孔半徑R（D）：

熒光信號可以從一個點源在焦平面上使用的探測器孔徑，當(dāng)收集半徑V（D）可以通過考慮點源的熒光團(tuán)的數(shù)量計算，吸收截面，和熒光量子效率。發(fā)出的光子的到達(dá)像平面的比例分布的通風(fēng)模式，當(dāng)集成在探測器孔徑半徑乘以實際采集到的信號檢測的效率收益。圖6（a）提出了圖形之間的典型關(guān)系規(guī)范化采集的信號從理論的點源和探測器孔徑半徑，在光學(xué)單元。關(guān)于信號在孔排除了，很明顯，需要產(chǎn)生最佳的共焦成像性能的小的孔，將拒絕大部分的發(fā)射信號。相反，開孔孔徑承認(rèn)一個較大比例的發(fā)射信號是有利的為點多余的背景的對比度降低，變得不可接受。幾個計算孔產(chǎn)生最佳信噪比的范圍大約在2到3（表示在圖上的曲線，一個紅色的部分圖6（a）），這取決于相對于背景信號量。它通常被認(rèn)為是可取的許多類型的調(diào)查收集至少百分之50的總的可用熒光，這是孔徑大于約2光學(xué)單元很容易實現(xiàn)，同時仍保留優(yōu)異的圖像的對比度。

因為達(dá)到足夠的信號電平和足夠的背景抑制獲得最佳聚焦性能是必要的評估和信噪比的信號背景比的要求相結(jié)合。背景許多不同的模式（有時稱為雜散光）已在文獻(xiàn)中提出的，他們不同的適用于不同類型的標(biāo)本，儀器的配置，以及是否反映信號或熒光成像檢測。在一些模型中，背景是假定為恒定的強(qiáng)度在整個檢測器的平面，與部分穿過針孔是與其面積成正比。這種模式被發(fā)現(xiàn)在共焦反射結(jié)構(gòu)的描述是有用的，其中重要的背景是由于散射在顯微鏡下，從光學(xué)元件反射的光路。

其他的模型被認(rèn)為是更適合于熒光顯微鏡，和這些不同了，信號和背景來源于空間要素的程度的假設(shè)，即在某些情況下，任意的，可變的。至少一個模型的應(yīng)力場的大小減少在降低噪聲的一個因素，并假定一個無限的試樣厚度的有限域的大小。在這種情況下，如果背景是均勻地從一個三維熒光試樣相比，點擴(kuò)展函數(shù)的大，它可能代表了熒光背景特征伴隨著熒光標(biāo)記從一個合適的模型。計算信號的信噪比，背景，內(nèi)容，和信號背景比出現(xiàn)在眾多的文學(xué)表現(xiàn)，并從這些，一定的概括是可能的基礎(chǔ)上的理論和實驗的共焦成像的針孔大小的因素，優(yōu)化性能的測定。

在具有熒光均勻分布的試樣，由于照明光束的光強(qiáng)分布，激發(fā)熒光相同的分?jǐn)?shù)是在傳統(tǒng)的寬視場顯微鏡收集從每個焦平面。作為一個結(jié)果，背景信號與線性增加試樣的厚度。一個關(guān)鍵屬性的共聚焦顯微鏡，然而，這是不包括光探測器孔徑以外的焦平面的大多數(shù)，如果相比景深厚度較大，背景信號的電平接近試樣厚度獨立。當(dāng)一個均勻的熒光濃度假定的背景信號，收集不同的試樣厚度的計算表明，循環(huán)探測器針孔半徑大于或等于試樣厚度的收集所有的樣品的熒光，致使廣角鏡的性能等價。

小針孔大小，背景是從試樣的飛機(jī)比半孔半徑的焦平面減少，并作為針孔半徑是低于約四分之一的試樣的厚度與孔徑大小，背景呈線性減小。在孔徑尺寸小于約4光學(xué)單元，只有約的背景進(jìn)入檢測器百分之1取得了有益的共焦成像特性，在一個適度的信號可能損失百分之25試樣的厚度為幾百倍的孔徑大小。

考慮到試樣厚度的影響及探測器孔徑大小對背景抑制允許為每個不同的值的信號背景比的計算。當(dāng)這些計算理論與理想的共焦配置具有零探測器孔徑進(jìn)行不同試樣厚度（最大化的信號背景比），信號的變化的背景下，已被證明是基本上是獨立的試樣厚度的值大于約100的光學(xué)單元。當(dāng)信號背景歸一化值為一零孔半徑，繪制量為厚的樣品，結(jié)果在一個曲線相似，如圖6所示的函數(shù)的孔半徑（B）。孔徑大小，最大限度地提高信噪比的范圍（如圖6也說明（一））曲線的紅色部分表示。信號背景比直接表示圖像的對比度，雖然最大比實際上不可能實現(xiàn)由于孔的尺寸必須增加承認(rèn)適當(dāng)?shù)男盘?，它是重要的，合理的對比可在光圈的大小，產(chǎn)生最佳的信噪比。

應(yīng)當(dāng)指出的是，雖然理論和實驗證據(jù)表明，最佳的孔徑大小可以確定，其中最大的軸向和橫向的共聚焦顯微鏡的分辨率，有許多因素有助于選擇妥協(xié)的孔徑尺寸滿足在特定情況下的成像要求。最佳光圈大小通常不是一個產(chǎn)生的最大分辨率。在典型的實驗意義更大的是攜帶信息的光子可以區(qū)分從背景信號和其他噪聲源的一個可行的時間框架內(nèi)的數(shù)量。最重要的變量包括樣品的特性（如厚度），熒光或其他成像信號產(chǎn)生的信號電平，伴隨著信號的噪聲水平，時間約束的信號采集的熒光團(tuán)漂白或試樣施加的變化，和特定的顯微鏡配置下考慮。