奧林巴斯顯微鏡在光學(xué)顯微鏡的數(shù)字成像

 在過去的幾年中，熒光顯微鏡的快速增長(zhǎng)的領(lǐng)域已經(jīng)從一個(gè)依賴于傳統(tǒng)的攝影用乳液型膜，一個(gè)電子圖像選擇的輸出。成像裝置是一種在奧林巴斯顯微鏡中最重要的組成部分，因?yàn)樗鼪Q定在什么水平的標(biāo)本的熒光可以檢測(cè)，相關(guān)結(jié)構(gòu)分解，和/或一個(gè)過程的動(dòng)態(tài)觀察和記錄。

范圍內(nèi)的光檢測(cè)方法和各種各樣的成像設(shè)備目前的技術(shù)人員使選擇過程中的困難和經(jīng)?；煜?。這個(gè)討論的目的是幫助理解光的檢測(cè)的基礎(chǔ)知識(shí)和為特定的應(yīng)用選擇合適的熒光顯微鏡檢測(cè)提供指導(dǎo)。圖1所示是一個(gè)落射熒光顯微鏡配備一個(gè)熱電制冷設(shè)計(jì)的圖像的標(biāo)本在很寬的曝光范圍在24位顏色在低光照水平最先進(jìn)的萬像素的數(shù)碼相機(jī)成像系統(tǒng)。這種類型的探測(cè)器以及其他的替代方案是在下面的段落綜述。

探測(cè)器的特性參數(shù)

電子成像傳感器的性能可以由數(shù)量的變量包括：光譜靈敏度，量子效率，空間分辨率，均勻性，信號(hào)/噪聲比，動(dòng)態(tài)范圍，和響應(yīng)速度。這些規(guī)格中詳細(xì)討論在我國(guó)部分復(fù)習(xí)在數(shù)字成像技術(shù)的概念但一個(gè)簡(jiǎn)短的描述，包括在這里為方便起見。光譜靈敏度是指對(duì)探測(cè)器信號(hào)作為入射光的波長(zhǎng)的函數(shù)。此參數(shù)通常是在量子效率來表示（量化寬松政策），測(cè)量探測(cè)器的生產(chǎn)能力從入射光子被檢測(cè)到的百分比電子電荷。限制空間分辨率一般從兩個(gè)高對(duì)比度對(duì)象之間的歧視，所需的最小分離測(cè)定，例如，黑色背景上的白色的點(diǎn)或線。對(duì)比度分辨率的一個(gè)重要因素，因?yàn)楦邔?duì)比度的對(duì)象（例如，黑色和白色的線）更容易解決比低對(duì)比度的對(duì)象（例如，相鄰的灰線）。

對(duì)電子探測(cè)器的空間分辨率更翔實(shí)的措施的調(diào)制傳遞函數(shù)（MTF）和對(duì)比度傳遞函數(shù)（CTF），都顯示了檢測(cè)器響應(yīng)的大小作為空間頻率的函數(shù)。CTF是從一系列的黑色和白色的酒吧，逐漸狹窄，近探測(cè)器響應(yīng)確定。每一條基本上是一個(gè)方波百分之100對(duì)比。MTF是一個(gè)表達(dá)式描述在一個(gè)正弦信號(hào)對(duì)比度的減少（60%對(duì)比度的正弦波）作為空間頻率的函數(shù)。一種電子檢測(cè)器的分辨率的限制，是最小的目標(biāo)大小，檢測(cè)到上述的噪聲閾值，一個(gè)概念，通常被稱為極限分辨率的頻率，這是空間頻率的MTF下降值為百分之3，對(duì)應(yīng)的可見檢測(cè)限。

電子探測(cè)器均勻性包含幾個(gè)變量：增益在傳感器上的變化，區(qū)域差異在噪聲和采樣效率（通常被稱為陰影），并在光的收集和傳輸效率的空間變化。電子探測(cè)器通常是由他們的信號(hào)/噪聲比（指定的S / N），一個(gè)衡量的變化的一個(gè)信號(hào)，表明信心的信號(hào)可估計(jì)的幅度。可見光具有固有的噪聲分量的光子通量的隨機(jī)性而產(chǎn)生的，它等于信號(hào)的平方根。噪聲也從各種其他來源如輸出放大器（讀出噪聲），和電子設(shè)備中常?？梢越档筒僮鳒囟冉档?。在沒有光的電子設(shè)備所產(chǎn)生的噪聲稱為暗電流或暗噪聲這是熱的，敏感的，作為一個(gè)探測(cè)器的溫度增加。

intrascene動(dòng)態(tài)范圍來自最大和最小強(qiáng)度，可在同一領(lǐng)域的同時(shí)檢測(cè)。插入鏡頭的動(dòng)態(tài)范圍代表強(qiáng)度可容納時(shí)，檢測(cè)器的增益，積分時(shí)間，鏡頭光圈范圍，或其他變量調(diào)整不同領(lǐng)域的觀點(diǎn)。的動(dòng)態(tài)范圍和信號(hào)/噪聲不應(yīng)混淆。動(dòng)態(tài)范圍是經(jīng)?？梢岳塾?jì)計(jì)算除以閱讀，信號(hào)相關(guān)的噪聲的最大信號(hào)。一種電子檢測(cè)器的響應(yīng)速度是由它的滯后它表示，進(jìn)行到下一個(gè)規(guī)定的時(shí)間間隔一點(diǎn)零一分以前的圖像的部分已經(jīng)過去了。

光電子檢測(cè)

常用的光探測(cè)器缺乏空間分辨的兩個(gè)例子是光電倍增管和光電二極管（如圖2所示）。這兩款器件采用光敏面捕捉入射光子產(chǎn)生感測(cè)和放大電子收費(fèi)。光電倍增管（光電倍增管）廣泛應(yīng)用于激光共聚焦顯微鏡和高端相機(jī)自動(dòng)曝光機(jī)構(gòu)以及光譜儀。這些設(shè)備的響應(yīng)時(shí)，光子撞擊光電陰極和解放電子被加速朝向由一系列弧形板電子倍增器，稱為光電倍增管。

光進(jìn)入的PMT的輸入窗口罷工陰極，它利用入射光子的能量釋放與峰值量子效率，最近已提高到約百分之40電子（見圖3中的GaAsP曲線）。陰極有效面積可以從幾毫米到直徑半米的尺寸范圍內(nèi)，這取決于應(yīng)用程序。

從金屬通道極鏈輸出電流成正比的光子撞擊光電陰極和電壓下降沿電極通道數(shù)。光譜靈敏度取決于陰極化學(xué)成分；最好的設(shè)備往往采用砷化鎵和紫外線，可見光敏感的，和從300到850納米的波長(zhǎng)范圍的紅外光（圖3）。光電倍增管光電陰極的均勻敏感和典型的光子分布在整個(gè)入射窗而不是集中到一個(gè)地區(qū)是不。由于光電倍增管不存儲(chǔ)電荷和響應(yīng)在幾納秒的輸入光通量的變化，它們可以用于快速檢測(cè)事件記錄。這些設(shè)備通常產(chǎn)生較低的噪聲值（暗電流）產(chǎn)生了巨大的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的電流輸出仍然準(zhǔn)確地反映光子通量。大的增益，表現(xiàn)出由這些設(shè)備是不犧牲帶寬的情況下獲得的，其范圍可以從100到1500 MHz的科學(xué)級(jí)光電倍增管在一個(gè)非常高的信號(hào)/噪聲比。

三電子探測(cè)器量子效率說明作為一種照明波長(zhǎng)的函數(shù)的在圖3中給出的光譜靈敏度曲線。兩曲線（圖3中的較低的曲線）與陰極組合物利用磷砷化鎵光電倍增管產(chǎn)生的（ga-as-p）或砷化鎵（砷化鎵）合金，而第三的曲線代表一個(gè)紫外透明窗口的硅光電二極管的響應(yīng)。

硅光電二極管的同時(shí)所生成的電流的光響應(yīng)迅速，但他們沒有伴隨電子倍增的PMT巨大的增益。在整個(gè)可見光譜的光電二極管有一個(gè)相對(duì)平坦的響應(yīng)（圖3）的量子效率高，從80到百分之90的范圍內(nèi)。該光敏表面的均勻性好、動(dòng)態(tài)范圍和響應(yīng)這些設(shè)備的速度是最高的光檢測(cè)器。然而，硅二極管產(chǎn)生大量的噪聲，（很熱）導(dǎo)致相對(duì)較差的信號(hào)-噪聲光子有限的條件下，如在熒光顯微鏡是常見的。光電二極管，將有限的增益已被開發(fā)（雪崩光電二極管，如圖2所示），被用在一些聚焦和寬場(chǎng)熒光顯微鏡。他們雖然已經(jīng)高達(dá)300倍的增益，他們表現(xiàn)出顯著的暗噪聲甚至當(dāng)冷卻到0°C.

面積探測(cè)器

這些設(shè)備通常分為兩類：管式和固態(tài)探測(cè)器。該光導(dǎo)攝像管攝像機(jī)（圖4）是一個(gè)管式探測(cè)器的光敏面“讀出”由掃描電子束。在攝像機(jī)的感光面店，而不是釋放電子的電荷在光電陰極。光子被光電傳感器改變其電阻在他們的網(wǎng)站的影響，以及當(dāng)前的掃描束流更容易通過這些網(wǎng)站產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)。因?yàn)楣鈱?dǎo)攝像管傳感器已在很大程度上取代了現(xiàn)代固態(tài)探測(cè)器和感興趣，只是由于歷史的意義，他們將不會(huì)在任何進(jìn)一步的細(xì)節(jié)考慮。

固態(tài)探測(cè)器組成的一個(gè)稠密矩陣將電荷存儲(chǔ)區(qū)的光電二極管。在基本概念的幾個(gè)變化是市售的包括流行的電荷耦合器件（CCD），電荷注入器件（CID），和互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS）檢測(cè)器。在這些探測(cè)器，硅二極管的光電傳感器（通常表示一個(gè)像素）被耦合到電荷存儲(chǔ)區(qū)，反過來，連接到一個(gè)放大器的讀出累積電荷量。在CID和CMOS探測(cè)器，每個(gè)傳感器具有與它相關(guān)聯(lián)的放大器和一排放大器的信號(hào)輸出并聯(lián)組合。雖然硅光電探測(cè)器的電荷存儲(chǔ)技術(shù)進(jìn)行了多年前的CCD的發(fā)展，為系統(tǒng)的一個(gè)合適的機(jī)制讀取這種存儲(chǔ)電荷需要被設(shè)計(jì)在裝置成為現(xiàn)實(shí)。在一個(gè)CCD，通常在整個(gè)陣列的角落里只有一個(gè)放大器，和所存儲(chǔ)的電荷依次通過并行寄存器線性串行寄存器然后到鄰近的讀出放大器的輸出節(jié)點(diǎn)。

由于CCD是目前最廣泛使用的熒光顯微鏡檢測(cè)，我們將更詳細(xì)地考慮其性能。分別將，在適當(dāng)?shù)那闆r下，這兩個(gè)類的CCD相機(jī)之間：消費(fèi)級(jí)和科學(xué)級(jí)。需要指出的是，盡管所有的電子探測(cè)器的模擬設(shè)備所產(chǎn)生的電流或電荷重要，與內(nèi)部數(shù)字相機(jī)最近表示，數(shù)碼相機(jī)，因?yàn)樗麄儧]有一個(gè)模擬信號(hào)輸出。

一些CCD相機(jī)用于科學(xué)應(yīng)用在室溫下操作，而另一些冷卻以降低暗電流（20°C降低溫度降低了十倍的CCD暗電流）。因?yàn)殡姾纱鎯?chǔ)威爾斯不充滿熱產(chǎn)生的暗噪聲在整合期間，長(zhǎng)時(shí)間曝光是可能的。冷卻相機(jī)科學(xué)往往都是使用指定的慢掃描因?yàn)樗麄兊膸俾适切∮谝粋€(gè)標(biāo)準(zhǔn)的攝像機(jī)。

視頻率攝像頭讀取存儲(chǔ)的電荷，輸出視頻領(lǐng)域每16.7毫秒符合推薦標(biāo)準(zhǔn)（表示RS-170或rs-330）在30幀每秒產(chǎn)生的每一幀由兩個(gè)交錯(cuò)的領(lǐng)域（歐洲標(biāo)準(zhǔn)格式要求50個(gè)領(lǐng)域一場(chǎng)每秒每20毫秒）。視頻開發(fā)滯后于我們的視覺系統(tǒng)的圖像生成速度比臨界閃爍頻率，視頻刷新頻率的閃爍不再是人眼能感知的。每個(gè)視頻領(lǐng)域，包含在整個(gè)框架百分之50的信息，得到的序列與結(jié)果，有一個(gè)16.7毫秒的時(shí)間差連續(xù)奇數(shù)或偶數(shù)掃描線之間的完整的圖像。如果一個(gè)視頻率攝像頭輸出停止并允許光線落在一段延長(zhǎng)的CCD，前兩個(gè)視頻領(lǐng)域產(chǎn)生包含所有的積分期間積累的信息。

交錯(cuò)的兩個(gè)視頻領(lǐng)域產(chǎn)生一個(gè)完整的視頻幀是從電子信號(hào)的傳輸和接收組件在電視發(fā)展的時(shí)間可用帶寬的限制導(dǎo)致的工程問題的巧妙的解決方案。現(xiàn)在更高頻率放大器和相關(guān)的電子許可證生產(chǎn)，儲(chǔ)存，并在不需要隔行掃描線的高達(dá)1000幀/秒，隨后顯示率。這樣的逐行掃描攝像機(jī)產(chǎn)生一個(gè)連續(xù)的掃描，從頂部至底部的圖像。這并不意味著在底部的得到頂線；相反，設(shè)備第一集成光子通量在整個(gè)傳感器，然后迅速取代積累的電荷在電荷存儲(chǔ)和傳輸區(qū)域，防止進(jìn)一步的照明。

兩個(gè)CCD設(shè)計(jì)常用來實(shí)現(xiàn)這種快速轉(zhuǎn)移：行間轉(zhuǎn)移CCD和幀轉(zhuǎn)移CCD，這是在圖5的示意性示出。行間轉(zhuǎn)移CCD采用電荷轉(zhuǎn)移通道（稱為“行間面具”圖5）立即相鄰的光電二極管，所積累的電荷可以被有效地轉(zhuǎn)移到通道圖像采集后已經(jīng)完成。行間轉(zhuǎn)移CCD電子設(shè)備可以關(guān)閉通過改變電壓的二極管所產(chǎn)生的電荷注入到襯底上而不是轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移的渠道。這些器件還包括一個(gè)電子“流失”防止開花，通常配有微透鏡陣列增加的填充因子和量子效率的光電二極管。

幀轉(zhuǎn)移CCD傳感器，使用一個(gè)兩部分的平行陣列的一半作為存儲(chǔ)區(qū)和由光緊掩避光。入射的光子可以落在裸露的部分的陣列和積累的電荷，然后迅速轉(zhuǎn)移到隱蔽存儲(chǔ)區(qū)域的電荷轉(zhuǎn)移到串行輸出寄存器。當(dāng)信號(hào)被集成在傳感器的感光部分，所存儲(chǔ)的電荷的讀出。這種體系結(jié)構(gòu)的一個(gè)缺點(diǎn)是感光的掩蔽區(qū)域的CCD電荷轉(zhuǎn)移過程中的涂抹，但這往往可以補(bǔ)償。

CCD的光譜靈敏度不同于一個(gè)簡(jiǎn)單的硅光電二極管檢測(cè)器由于CCD表面具有通道用于電荷轉(zhuǎn)移是由多晶硅柵電極屏蔽。這些結(jié)構(gòu)的吸收波長(zhǎng)較短，減少設(shè)備的藍(lán)色靈敏度。一個(gè)典型的光譜靈敏度曲線的消費(fèi)者或者科學(xué)級(jí)CCD是如圖6所示（標(biāo)準(zhǔn)CCD）應(yīng)該指出的是，百分之40的量子效率峰值明顯低于一個(gè)人在硅光電二極管。最近，信道的透明度已經(jīng)在一些科學(xué)級(jí)CCD藍(lán)靈敏度大幅改善增加（藍(lán)加曲線圖6）。由于信道的損失是在背照CCD完全消除。在本設(shè)計(jì)中，光照射到的區(qū)域中已被蝕刻直到它是透明的CCD后（約10-15微米相應(yīng)厚度）。由此產(chǎn)生的光譜靈敏度曲線，圖6所示（背照式CCD），說明了量子效率高，能與此配置實(shí)現(xiàn)。然而，結(jié)果在一個(gè)微妙的背面減薄，相對(duì)昂貴的傳感器，到目前為止，只有采用科學(xué)級(jí)CCD相機(jī)中的高端。

一種CCD的分辨率是一個(gè)光電二極管和他們的相對(duì)投影圖像的大小的數(shù)目的功能。現(xiàn)在1000×1000傳感器CCD陣列的科學(xué)級(jí)攝像機(jī)是家常便飯。在消費(fèi)者和科學(xué)級(jí)CCD制造是傳感器的尺寸減小的趨勢(shì)，和相機(jī)，光電二極管小4×4微米的消費(fèi)市場(chǎng)是目前可用的。一個(gè)CCD攝像頭像素與6.7-micron典型的MTF曲線如圖7所示。百分之60正弦波投射到傳感器表面的空間頻率上繪制的橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)得到的調(diào)制率。極限分辨率通常被定義為百分之3的調(diào)制水平。

一個(gè)對(duì)象的足夠的分辨率，只能是在至少兩個(gè)樣品進(jìn)行了為每個(gè)分辨單元實(shí)現(xiàn)（許多研究人員喜歡每分辨單元三樣品以確保有足夠的采樣）。在免疫熒光顯微鏡下，在波長(zhǎng)為550納米的使用1.4數(shù)值孔徑透鏡衍射極限分辨阿貝單位是0.21微米。如果使用100倍的目的，對(duì)CCD面衍射受限點(diǎn)投影的大小是21微米。10.5個(gè)×10.5微米傳感器的大小只允許光學(xué)和電子分辨率相匹配，與7×7微米大小的首選傳感器。雖然在一個(gè)CCD提高空間分辨率小的傳感器，他們也限制了設(shè)備的動(dòng)態(tài)范圍。表1提供了建議在熒光顯微鏡中常用的目標(biāo)傳感器的像素尺寸。

一種CCD電荷存儲(chǔ)容量的各個(gè)二極管的大小比例，使得最大數(shù)量的電子存儲(chǔ)大約1000倍的橫截面積的每個(gè)光電二極管。因此，一個(gè)CCD 7×7微米的光電二極管，應(yīng)該有一個(gè)最大的電荷存儲(chǔ)容量（全阱容量）49000的電子或空穴。一個(gè)孔的區(qū)域的硅的電子來構(gòu)成檢測(cè)的光子同樣有效的和可用的測(cè)量。“電子”將主要用于在討論雖然很多CCD讀出的孔的數(shù)量，而不是電子的產(chǎn)生。由于CCD沒有固有增益，一個(gè)電子空穴對(duì)每個(gè)檢測(cè)到的光子的積累。一種CCD的動(dòng)態(tài)范圍通常定義為滿阱容量除以相機(jī)噪聲。相機(jī)的噪聲是正交的總和，，黑暗的和讀出噪聲。最近在CCD設(shè)計(jì)上的改進(jìn)已經(jīng)大大減少到可以忽略的水平和降低暗電荷的讀出噪聲像素的約10電子。即使室溫相機(jī)可能有這樣一個(gè)低暗信號(hào)，它可以在10秒或更少的時(shí)間忽視整合。冷卻進(jìn)一步降低暗信號(hào)，允許更長(zhǎng)的整合期，長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)，無明顯的暗電荷積累。因此，一個(gè)49000電子全井產(chǎn)能的CCD 10電子讀出噪聲可以忽略不計(jì)的暗噪聲的動(dòng)態(tài)范圍是4900左右，需要一個(gè)12位模數(shù)轉(zhuǎn)換，或4096級(jí)灰度分辨率，充分利用圖像傳感器的動(dòng)態(tài)范圍。

一種CCD與49000個(gè)電子的滿阱容量已達(dá)到最大的信號(hào)/噪聲約220（49000的平方根）。當(dāng)然，相機(jī)的噪聲會(huì)增加，正交，對(duì)光子統(tǒng)計(jì)噪聲和減少低于此值的最大信噪比。圖像中的均勻區(qū)域的信噪比任何一個(gè)簡(jiǎn)單的估計(jì)可以由平均強(qiáng)度的感興趣區(qū)域劃分的區(qū)域的強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

消費(fèi)者經(jīng)常使用的相機(jī)有一個(gè)長(zhǎng)方形的格式CCD的縱橫比為4的：3。這意味著圖像的高度是3 / 4的寬度應(yīng)與基于景觀的世界觀視頻標(biāo)準(zhǔn)。事實(shí)上，消費(fèi)級(jí)產(chǎn)品設(shè)計(jì)的新一代HDTV采用16：9的縱橫比。科學(xué)成像，另一方面，最好是用平方圖像由方形像素作為他們更適合于數(shù)字圖像處理研究。

CCD傳感器的一致性非常好，具有小于百分之10的變異之間的增益光電二極管。然而，遮蔭可以引入圖像從CCD相機(jī)由于電荷轉(zhuǎn)移效率。CCD的操作要求每個(gè)包電荷潛在的光電二極管被傳送到讀出放大器。這種轉(zhuǎn)移是通過一系列的并行和串行移位，移位沿芯片向一個(gè)角落包含讀出放大器的電荷排。如果讀出放大器是一個(gè)1000×1000傳感器CCD的右上角，從最近的那個(gè)角落，將只有一次向上轉(zhuǎn)移到串行移位寄存器的光敏電荷（平移）和一次向右（串行移位）到達(dá)放大器。另一方面，從光電二極管的電荷在左下角，將向上移動(dòng)1000次，1000次被讀出向右。如果轉(zhuǎn)換效率為每班百分之99.9，只有百分之13.5的左下的光電二極管的電荷積累在必需的2000位移保持。這個(gè)電荷損失會(huì)使左下角到右上暗得多，也因?yàn)閺南噜彽墓怆姸O管的電荷溢出會(huì)模糊或涂抹區(qū)域的圖像。這個(gè)概念是示意性地使用圖8中的藍(lán)色像素代表集成的電荷密度的說明。在左下角的CCD像素（最遠(yuǎn)的像素的暗藍(lán)色）顯示慢慢失去顏色的強(qiáng)度的電荷轉(zhuǎn)移是第一并行串行移位寄存器，然后連續(xù)到輸出節(jié)點(diǎn)。接近節(jié)點(diǎn)的像素（右上的“最近”的像素）也在深藍(lán)色的說明和經(jīng)歷只有兩步跳到輸出節(jié)點(diǎn)的累積的電荷轉(zhuǎn)移效率為百分之99.8，產(chǎn)量。

慢掃描CCD相機(jī)提高電荷轉(zhuǎn)移效率的冷卻CCD和減慢傳輸率。在視頻率CCD相機(jī)需要高速的電荷轉(zhuǎn)移需要不同的策略。這些相機(jī)，讀出放大器增益調(diào)整，以彌補(bǔ)失去的每一行進(jìn)行采樣，額外的像素的圖像區(qū)域以外的費(fèi)用。額外的增益所需的下行不可避免地增加在高度校正區(qū)域的傳感器的噪聲。

一些控制讀出速率以及大小的像素構(gòu)成的傳感器慢掃描CCD相機(jī)允許的。視頻率CCD相機(jī)簡(jiǎn)單、不允許這樣的控制。減緩讀出通常會(huì)降低閱讀相關(guān)聯(lián)的電荷放大器的噪聲，有利的情況時(shí)，光子通量很低，信號(hào)可以產(chǎn)生相對(duì)緩慢（在第二次或兩個(gè)而不是33毫秒）。科學(xué)級(jí)CCD相機(jī)通常提供兩個(gè)或兩個(gè)以上的讀出速率，速度可能會(huì)抵消噪聲。

在一個(gè)科學(xué)級(jí)CCD像素的大小可能會(huì)增加的分級(jí)，在這一過程中從一簇相鄰的光電二極管的電荷匯集和作為如果它來自一個(gè)更大的探測(cè)器。在分級(jí)，幾個(gè)移向串行寄存器和輸出節(jié)點(diǎn)的存儲(chǔ)區(qū)域發(fā)生之前讀出。裝箱的程度取決于有多少變化發(fā)生在存儲(chǔ)電荷讀取，與唯一的限制是對(duì)串行寄存器的電荷存儲(chǔ)容量（通常是一個(gè)單一的光電二極管的兩倍）或輸出節(jié)點(diǎn)（通常是三倍，光電二極管）。寄存器的串行輸出節(jié)點(diǎn)的最大電荷存儲(chǔ)容量是不是在大多數(shù)熒光顯微鏡的應(yīng)用關(guān)注因?yàn)檠b箱時(shí)，光的水平很低，很少檢測(cè)到的光子。裝箱使研究者貿(mào)易空間分辨率的靈敏度。

有各種各樣的科學(xué)CCD的市場(chǎng)上，具有廣泛的陣列和單個(gè)像素的尺寸。幾種最受歡迎的CCD數(shù)字成像相機(jī)用顯微鏡發(fā)現(xiàn)列于表2。目前，最流行的是索尼icx205ak行間轉(zhuǎn)移CCD逐行掃描芯片支持高幀讀出速率為30幀/秒。本CCD有1360×1024有源像素陣列使用4.65×4.65平方微米的像素產(chǎn)生一個(gè)8-millimeter圖像大小。該芯片還具有靈敏度高，低電流，低涂片，優(yōu)良的抗暈特征，和一個(gè)連續(xù)變速快門。

慢掃描CCD相機(jī)也允許感興趣的讀出區(qū)域。這意味著一個(gè)選定的部分的圖像可以顯示和累積電荷的剩余丟棄。幀速率一般在檢測(cè)區(qū)域的大小減小而增大。例如，一個(gè)CCD與1000×1000傳感器的大小和十幀/秒的輸出速率可以讀出區(qū)域減少到100×100二極管產(chǎn)生100幀/秒。交易的視場(chǎng)和幀速率，調(diào)查員可以調(diào)整到一個(gè)更廣泛的范圍內(nèi)的實(shí)驗(yàn)條件下比將有可能與一個(gè)固定的幀速率的視頻攝像機(jī)。

熒光弱光成像級(jí)別

由于在氧的存在下的光破壞的熒光染料的問題（“漂白”）和對(duì)熒光染料，可以涉及一個(gè)單一的區(qū)域數(shù)的限制，各種敏感的電子探測(cè)器用熒光顯微鏡。只有約5%至10%的發(fā)射的光從激發(fā)熒光的收集和轉(zhuǎn)移到在一個(gè)典型的落射熒光顯微鏡傳感器。有捕捉多這有限的光通量盡可能的兩種方法：通過慢掃描CCD積分，如前所述，或圖像增強(qiáng)和捕獲的視頻速率或逐行掃描CCD相機(jī)。總的結(jié)論是，慢掃描CCD相機(jī)的冷卻，會(huì)產(chǎn)生更高的信噪比增強(qiáng)型CCD，提供了足夠的積分時(shí)間是可用的。

圖像增強(qiáng)器（通過11看在圖9的例子）被開發(fā)用于增強(qiáng)夜視軍事用途。他們有一個(gè)輸入光電陰極跟隨一個(gè)微通道板電子倍增器和磷光輸出屏幕。在這些設(shè)備的新一代光電陰極，而類似于光電倍增管，具有更高的量子效率（百分之50）在光譜的藍(lán)端。的微通道板的增益是可調(diào)的超過約80000的典型的最大范圍寬（檢測(cè)到的光子在輸入導(dǎo)線從熒光屏的脈沖80000光子）。熒光體與眼睛的光譜靈敏度和往往是不理想的一個(gè)CCD。的增強(qiáng)型CCD分辨率取決于像增強(qiáng)器和CCD，但通常是由增強(qiáng)器微通道板幾何有限的單獨(dú)的CCD百分之75。圖像增強(qiáng)器的最新一代（表示藍(lán)加三代或第四代；圖9）采用較小的微通道（6微米直徑）和更好的包裝幾何比以前的模型的分辨率和鐵絲網(wǎng)固定模式噪聲消除困擾早期的設(shè)備得到大幅提高。

圖像增強(qiáng)器相比慢掃描CCD相機(jī)很難獲得超過256倍的強(qiáng)度范圍內(nèi)有一個(gè)減少的intrascene動(dòng)態(tài)范圍（8位）從一個(gè)CCD相機(jī)增強(qiáng)。像增強(qiáng)器增益可以迅速地改變以適應(yīng)場(chǎng)景中的亮度變化，從而增加插入鏡頭的動(dòng)態(tài)范圍。事實(shí)上，由于圖像增強(qiáng)器可快速門控（關(guān)閉或在幾納秒），相對(duì)明亮的對(duì)象可以被可視化通過減少在“開”的時(shí)間。一個(gè)門控加劇CCD相機(jī)，可變?cè)鲆媸鞘惺鄣?2個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍。門控加劇CCD相機(jī)，是最需要的時(shí)間分辨熒光顯微鏡的應(yīng)用由于探測(cè)器必須打開納秒或獲得快速調(diào)制同步光源下。

從光電陰極的熱噪聲以及從微通道板電子倍增噪聲降低的信號(hào)-噪聲加劇CCD相機(jī)在低于慢掃描CCD。這些組件的光子通量的統(tǒng)計(jì)性質(zhì)產(chǎn)生的噪聲的貢獻(xiàn)取決于該裝置和陰極溫度的增益。一般來說，減少對(duì)強(qiáng)化階段的增益來限制噪聲雖然加劇CCD相機(jī)可帶一個(gè)冷陰極。

加劇CCD相機(jī)有一個(gè)非?？斓捻憫?yīng)時(shí)間由輸出磷光體的CCD相機(jī)定常讀出來的公司是在圖像采集中最慢的一步。由于低光通量的熒光染料結(jié)合或活細(xì)胞內(nèi)的CCD相機(jī)所產(chǎn)生的強(qiáng)化，經(jīng)常被用來研究動(dòng)態(tài)事件和離子敏感的熒光比例成像。同時(shí)或幾乎同時(shí)采集在不同的激發(fā)或發(fā)射波長(zhǎng)的兩個(gè)圖像是比所需的CCD相機(jī)成像和強(qiáng)化有必要的速度和靈敏度。

一種混合的圖像增強(qiáng)器和CCD相機(jī)是最近推出的，電子轟擊CCD（EBCCD；圖10）。在該裝置中，光子的光陰極類似于在一個(gè)圖像增強(qiáng)器檢測(cè)。釋放的電子被加速的差距和一個(gè)CCD的背面?zhèn)鹊挠绊憽?/trans>這些高能電子產(chǎn)生多電荷導(dǎo)致在一個(gè)適度的增益幾百的CCD。該裝置在一個(gè)冷卻的優(yōu)點(diǎn)，慢掃描CCD是額外的增益和相應(yīng)的速度；主要缺點(diǎn)是光電陰極的量子效率的降低和減少動(dòng)態(tài)范圍。增強(qiáng)型CCD相比，電子轟擊CCD通常具有較高的空間分辨率和更好的信噪比在中等光照水平，但有限的增益調(diào)節(jié)范圍和適度的低光水平的檢測(cè)能力，使電子轟擊CCD的固態(tài)相當(dāng)過時(shí)的坐（硅增強(qiáng)目標(biāo)；圖11）相機(jī)。

電子與視覺檢測(cè)

人眼如何與電子探測(cè)器相比呢？圖6說明了眼睛的光譜靈敏度曲線，對(duì)應(yīng)于明視覺和暗視覺，從視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞產(chǎn)生（圖12），分別為。峰值靈敏度是在綠色（555納米的光與暗在507納米）有明視覺和暗百分之10百分之3的最大量子效率。我們的空間分辨率是不均勻的，不均勻分布的錐。最高密度發(fā)生在黃斑中心凹視錐細(xì)胞之間的距離大約是1.5微米，給我們一個(gè)5到6微米的空間分辨率的視網(wǎng)膜上的限制。在單色（黑色和白色）恒定光照條件下，視覺的intrascene動(dòng)態(tài)范圍只有約50倍（6位）。我們的視覺色素視紫紅質(zhì)，很小，熱噪聲，和最小可檢測(cè)信號(hào)的暗適應(yīng)后約100至150的光子在光瞳或約10至15的光子在視網(wǎng)膜。在視覺檢測(cè)限眼睛/噪聲信號(hào)大約是3：1。滯后約20毫秒在高光的水平，約100毫秒在昏暗的照明。

很明顯，與我們的眼睛，一個(gè)科學(xué)級(jí)CCD相機(jī)具有廣闊的光譜靈敏度，更高的量子效率，更大的整合能力，更均勻，更好的intrascene動(dòng)態(tài)范圍（更多的“位”），類似的或更高的信號(hào)/噪聲，但較低的空間分辨率。當(dāng)與我們的視覺系統(tǒng)，微光攝像機(jī)有更寬的光譜范圍，減少滯后和更大的靈敏度和分辨率的光子有限的條件下。

選擇合適的相機(jī)

沒有一個(gè)單一的探測(cè)器將在熒光顯微鏡和調(diào)查所有的要求往往是被迫妥協(xié)。此外，選擇是困難因?yàn)槁龗呙柘鄼C(jī)的速度越來越快、視頻攝像機(jī)通常冷卻率。

當(dāng)時(shí)間是關(guān)鍵參數(shù)，增強(qiáng)的相機(jī)往往是唯一的選擇。如果被調(diào)查事件是快速但可精確觸發(fā)，慢掃描CCD在突發(fā)或高速模式操作可能是合適的。然而，當(dāng)事件是不容易預(yù)測(cè)和試樣必須連續(xù)監(jiān)測(cè)在低入射光通量的加大，CCD探測(cè)器的選擇。因?yàn)檫@個(gè)原因，單分子熒光的研究通常采用CCD相機(jī)增強(qiáng)。

當(dāng)時(shí)間是可用于圖像融合，慢掃描CCD相機(jī)通常會(huì)在各方面優(yōu)于增強(qiáng)相機(jī)，在很大程度上是由于其高量子效率和更低的噪音。冷卻總是提高相機(jī)性能雖然差異可能不可忽視的積分時(shí)間在幾秒或更短和數(shù)字化水平為10到12位或更少。對(duì)于涉及數(shù)字反卷積的應(yīng)用，選擇的檢測(cè)器是一個(gè)冷卻，科學(xué)級(jí)，慢掃描能夠產(chǎn)生高分辨率的相機(jī)，14位到16位的圖像。然而，一些最新的CCD有這么小的像素融合的時(shí)期必須限制以避免威爾斯飽和，因此，動(dòng)態(tài)范圍和峰值信噪比可能沒有比那些一個(gè)加劇CCD。

兩種類型的彩色CCD攝像機(jī)用于科學(xué)應(yīng)用：一個(gè)單一的CCD具有波長(zhǎng)選擇濾波器或一三傳感器（三芯片）相機(jī)。使用過濾器來產(chǎn)生紅，視場(chǎng)的綠色和藍(lán)色的版本。單傳感器的相機(jī)利用貼壁濾波器，濾波器輪或液晶可調(diào)諧濾波器獲得的紅色，綠色，和藍(lán)色圖片。當(dāng)一個(gè)可調(diào)諧濾波器或?yàn)V波器采用三輪，必須獲得序列圖像。三傳感器的相機(jī)有一個(gè)分束棱鏡和裝飾的過濾器，使每個(gè)傳感器圖像的適當(dāng)?shù)念伾瑫r(shí)獲得所有三個(gè)圖像。總是，彩色攝像機(jī)是比他們的同行不敏感的單色由于附加束波長(zhǎng)選擇元件。在一些應(yīng)用中，特別是免疫熒光，靈敏度的損失是由能夠捕獲多波長(zhǎng)同時(shí)偏移。此外，一些彩色攝像機(jī)采用壓電控制易位的機(jī)制來抵消CCD稍達(dá)到較高的分辨率，從而提高采樣頻率。

最近在CMOS相機(jī)的性能改進(jìn)，預(yù)示著一個(gè)潛在的未來的重要作用，這些設(shè)備在熒光顯微鏡。CMOS相機(jī)有一個(gè)放大器和數(shù)字化與集成相關(guān)格式的每個(gè)光電二極管。與每個(gè)像素有助于減少噪音和失真水平個(gè)體的放大器，但他們也引起一個(gè)神器被稱為“固定模式噪聲”來自開關(guān)和采樣個(gè)別像素放大器的文物。這表現(xiàn)在重現(xiàn)模式的“斑點(diǎn)”的CMOS有源像素傳感器設(shè)備產(chǎn)生的圖像的行為。大量的研究工作已投入這一問題的解決，以及噪聲的殘留水平已經(jīng)大大降低了CMOS傳感器。其結(jié)果是一個(gè)廉價(jià)的，緊湊的，靈活的檢測(cè)器結(jié)合硅檢測(cè)美德沒有電荷轉(zhuǎn)移的問題。CMOS傳感器允許單個(gè)光電二極管的增益控制，感興趣的讀出區(qū)域，高速采樣，電子快門和曝光控制。他們有非凡的動(dòng)態(tài)范圍以及計(jì)算機(jī)接口的一個(gè)理想的格式。它是可能的，他們將取代在不久的將來科學(xué)應(yīng)用CCD相機(jī)。