徠卡顯微鏡EM ACE600電子束
甘油噴霧/低角度旋轉(zhuǎn)遮蔽是在生物學(xué)用于可視化的結(jié)構(gòu)，得到與其他技術(shù)不足等相反，制劑技術(shù)，由于其直徑小。此方法通常用于標(biāo)本，其中包括與卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域或DNA的蛋白質(zhì)。
樣品制備包含三個(gè)步驟:首先,標(biāo)本的小水滴懸浮在一個(gè)緩沖區(qū)包含30%甘油和乙酸銨緩沖噴灑到新鮮貼近,干凈的云母片表面。 第二步,樣品轉(zhuǎn)移到高真空蒸發(fā)器:這個(gè)工具允許存款薄層的電子致密物質(zhì)(通常是Pt、W或非盟)在低角度到樣品。 蒸發(fā)物質(zhì)積累主要在提高樣本,從而提供了對(duì)比。 隨后,一層支持C是蒸發(fā)到標(biāo)本提供支持。 在第三步中,副本形成脫離的云母和安裝到EM電網(wǎng)教具電子顯微鏡檢查。
徠卡EM ACE600配備Pt / C和C電子束蒸發(fā),第二步可以完全自動(dòng)化:從樣本已經(jīng)轉(zhuǎn)移到收件人的高真空蒸發(fā)器,直到程序結(jié)束,儀器充分控制真空,標(biāo)本的位置相對(duì)于金屬/碳源和沉積材料的厚度。
編程序列
兩個(gè)電子***支使用在這個(gè)準(zhǔn)備的過程中,這兩個(gè)需要脫氣,以避免相當(dāng)退化的真空由于加熱在當(dāng)下的實(shí)際蒸發(fā)開始。 而不是兩個(gè)后續(xù)德加/泵/蒸發(fā)周期Pt / C和C,它是首選先德加兩***,然后泵需要相當(dāng)長的時(shí)間來達(dá)到一個(gè)好的過程真空蒸發(fā)材料。 一個(gè)自動(dòng)序列正在這里描述實(shí)現(xiàn)該方法。 Pt / C***安裝在正確的端口,C***在左邊。
材料
材料使用Pt標(biāo)準(zhǔn)定義的“白金德加”設(shè)置,50 W脫氣的力量,和120秒脫氣。
材料使用C標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置“碳德加”的定義,75 W脫氣的力量,和300秒脫氣。
兩種材料“鉑沒有德加”和“碳不德”具有相同的屬性定義為原始材料,但脫氣是停用。
流程
過程“脫氣Pt / C”旨在德加Pt / C***只是編程使用的材料“白金德加”。 這一過程將開始為1.0×10 4 mbar,蒸發(fā)低30 W的力量,和目標(biāo)厚度為0.0 nm打開快門后立即終止。 設(shè)置階段地位因此過時(shí)了。
脫氣過程”C”旨在德加C***只是編程使用材料“碳德加”。 這一過程將開始為1.0×10 4 mbar,蒸發(fā)低30 W的力量,和目標(biāo)厚度為0.0 nm打開快門后立即終止。 設(shè)置階段地位因此過時(shí)了。
過程“陰影Pt / C”程序使用以下設(shè)置:材料“鉑不德”,功率100 W目標(biāo),目標(biāo)厚度2.0 nm,真空< 2.5×10 5 mbar、舞臺(tái)在-54°傾斜(對(duì)應(yīng)于5°相對(duì)于***),最大工作距離,旋轉(zhuǎn)5(最大值)。
“支持度”是編程過程使用以下設(shè)置:材料“碳無德”,120 W targat力量,目標(biāo)厚度6.0 nm,真空< 2.5×10 5 mbar,舞臺(tái)上20°傾斜(相對(duì)于水平),最大工作距離,旋轉(zhuǎn)5(最大值)。
序列
一個(gè)序列組成的“脫氣Pt / C”,“脫氣C”,“陰影Pt / C”,“支持度”準(zhǔn)備。
準(zhǔn)備
在實(shí)驗(yàn)之前,Pt / C和C***清洗徹底,細(xì)絲的目標(biāo)和建立根據(jù)手冊。 Pt / C***是安裝在真空室的正確的端口,C***在左邊。 佬司的儀器成立(低角度旋轉(zhuǎn)跟蹤)階段和石英晶體在側(cè)臥位。
130μg /毫升dsDNA長度1010完全(對(duì)應(yīng)343海里)在噴灑稀釋1:20緩沖區(qū)(100中毒/ l醋酸銨,30%的甘油,pH值7.6)。 小水滴噴灑噴霧裝置中描述到新開辟的云母片表面大約2×2毫米大小和安裝與雙面膠帶在50毫米圓形濾紙。
噴灑后,對(duì)濾紙樣品立即轉(zhuǎn)移到隨時(shí)準(zhǔn)備徠卡EM ACE600和疏散。 上面列出的順序與被處決,商會(huì)是在完成時(shí)自動(dòng)排放。
濾紙上的副本被從真空室和轉(zhuǎn)移到潮濕的cham-ber,制成的塑料盤子,封口膜(使樣本變濕),和濕濾紙。 促進(jìn)超然的復(fù)制品,他們孵化在烤箱45°C 30分鐘。
隨后,副本是浮在表面的蒸餾水在一個(gè)白盤子里,挑了一個(gè)un-filmed 400目銅網(wǎng)格,ddH轉(zhuǎn)移到另一個(gè)盤 2 O所有殘余有機(jī)物的去除(甘油),拿起另一個(gè)網(wǎng)格。 多余的水從側(cè)面涂抹和技巧的濾紙的鉗,樣本被風(fēng)干。
空氣干燥的副本在透射電子顯微鏡下觀察到在80千伏,感興趣的區(qū)域可以通過晶體的殘留鹽形成的中心干水滴中描述。 圖像記錄用CCD相機(jī)的像素大小0.373 nm /像素。
圖1:如在透射電子顯微鏡中的文本描述和可視化制備的低角度旋轉(zhuǎn)遮蔽的DNA。單個(gè)分子是清楚可見的，并顯示出良好的對(duì)比度。使用斐濟(jì)，340納米的平均長度測量組（n =8）。 （下圖）在較高的放大倍數(shù)圖像允許評(píng)估對(duì)比增強(qiáng)金屬的粒度。桿（頂部，底部）= 100納米