奧林巴斯顯微鏡的鈣離子探針

 Cameleons 是一類新的活細(xì)胞，結(jié)果在熒光共振能量轉(zhuǎn)移 （煩惱） 在鈣離子存在下的構(gòu)象變化通過(guò)運(yùn)作中的鈣離子濃度的指標(biāo)。在過(guò)去，熒光探針 Fura 2、 印-1 和熒光 3 等都非常受歡迎的測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的波動(dòng)。1997 年，博士淳脅 （瓦科、 日本理研腦科學(xué)研究所） 的開(kāi)發(fā)一種新型鈣離子測(cè)量探針。這種探頭由人工種蛋白質(zhì)組成從綠色熒光蛋白 （GFP），修改，和一名叫Cameleon （變色龍爬蟲(chóng)類，但從名稱中刪除"h"）。Cameleon 分子結(jié)構(gòu)被建模為一種融合產(chǎn)品 （具有不同的激發(fā)和發(fā)射特性） 的兩種熒光蛋白質(zhì)、 鈣調(diào)蛋白 （CaM） 和鈣調(diào)素結(jié)合域的肌球蛋白輕鏈激酶 (M13) 之間。鈣調(diào)素是綁定與游離鈣離子的能力，它已綁定的鈣離子后，M13 鏈可以綁定與鈣調(diào)素。這些四種蛋白的基因都線性，加入并融合基因表達(dá)的各種各樣的細(xì)胞。

Cameleon 嵌合體為是***在基因工程和苦惱，生物物理技術(shù)測(cè)量?jī)蓚€(gè)間隔緊密的分子之間的距離中的實(shí)際應(yīng)用。一對(duì)為 FRET熒光蛋白被選擇他們的特征吸收和發(fā)射譜。一個(gè)熒光基團(tuán) (捐助者) 的激發(fā)能量轉(zhuǎn)移到另一個(gè) （受體） 的磁偶極相互作用，沒(méi)有捐助熒光發(fā)射。捐助者排放和受體吸收譜必須為 FRET 發(fā)生重疊。此外，能量轉(zhuǎn)移發(fā)生只有當(dāng)兩個(gè)熒光分子內(nèi)的每個(gè)其他幾個(gè)納米。對(duì)熒光蛋白，特別是一青色和黃色或藍(lán)色和綠色的 （CFP/YFP 和 BFP/GFP） 對(duì)一般選擇為 FRET 實(shí)驗(yàn)由于其光譜特性。

Cameleon 分子由四個(gè)域 （見(jiàn)圖 1）。熒光蛋白加入在彼此在鈣離子，沒(méi)有這兩個(gè)端站，但在鈣離子存在下凸輪激活鏈接器環(huán)繞的 M13 蛋白質(zhì)。Cameleon 嵌合體的三級(jí)結(jié)構(gòu)然后改變，使兩個(gè)熒光蛋白化合物與能量傳遞的范圍。在低鈣濃度環(huán)境中，cameleon 分子是展開(kāi)和 CFP 熒光時(shí)發(fā)生分子興奮與 442 納米的光。然而，當(dāng)鈣離子濃度增加時(shí)，CFP 熒光減少和 YFP 熒光增加由于共振能量轉(zhuǎn)移。

綁定的鈣的鈣調(diào)素基團(tuán)的 cameleon 生產(chǎn)在整個(gè)分子，空間接近的位置的兩個(gè)熒光蛋白的構(gòu)象變化。這種構(gòu)象，偶極能量轉(zhuǎn)移由興奮的 CFP 蛋白刺激 YFP 產(chǎn)生次生熒光在 530 納米。Cameleon 設(shè)計(jì)代表*次的基因編碼的鈣傳感器，并提供機(jī)會(huì)，在一種相對(duì)的非侵入性的方式監(jiān)測(cè)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理動(dòng)力學(xué)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度可以通過(guò)熒光比例成像中的兩種類型的 cameleon 分子胞內(nèi)鈣離子濃度變化的比率確定。當(dāng) cameleon 分子已被興奮在 442 的納米 （使用從氦鎘激光線） 時(shí)，可以在使用激光共聚焦掃描顯微鏡的 485 和 530 納米同時(shí)檢測(cè)其熒光。

在圖 2 中，提出了一種由 cameleon 監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)一典型的鈣離子。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，cameleon 嵌合體是類似于上文所述的 CFP/YFP 變體。這兩個(gè)基因都在 HeLa 細(xì)胞轉(zhuǎn)染脂技術(shù)同時(shí)表達(dá)。在圖 2 (a)，說(shuō)明鈣水平?jīng)]有興奮劑或鎮(zhèn)靜劑的存在。由 0.1 毫組胺刺激產(chǎn)生急劇增加鈣離子濃度的 （圖 2(b))），同時(shí)增加了 0.1 毫賽庚啶引出的拮抗作用 （結(jié)果中的鈣水平降低的圖 2(c))。