徠卡顯微鏡激光觀察神經(jīng)纖維植物細胞
植物次生代謝產(chǎn)物參與各種植物生理生化過程，從而使植物要成功地與他們的生物和非生物環(huán)境互動。這些化合物在組織和細胞水平的分布格局表明植物防御系統(tǒng)如何組織的有針對性和精確的方式管理環(huán)境的挑戰(zhàn)。在這里我們目前我們的出版物使用激光顯微切割 （LMD） 來分隔不同的植物細胞類型的概述。
徠卡 LMD6000 和徠卡 LMD7000 的激光顯微切割系統(tǒng)被用于解剖的特定單元格、 單元格人口和微觀組織塊不同的植物，如Dilatris物種 （Haemodoraceae） ，挪威云杉 （松科云杉冷杉，金絲桃屬植物物種 （Hypericaceae），油菜十字花科植物甘藍型油菜L.）， Colquhounia 黑老虎變種翅果油樹（唇形）和******（次生） 。LMD 程序，LMD (A)，(B)、 激光顯微切割技術術后樣品處理 (C) 和 (D) 有針對性的植物次生代謝產(chǎn)物的分析樣品制備的一般工作流程是所示，討論了為每個樣品 （表 1）。介紹了相同或類似的方法在只有一次詳細介紹.
表 1： LMD 過程的工作流。
一步 | |
|---|---|
A | 樣品的制備 |
B | 激光顯微切割技術 |
C | 術后樣品處理 |
D | 植物次生代謝物的測定 |
作為一種工具 LMD 收獲從分泌腔Dilatris pillansii巴克， Dilatris 銅錘Berg 的樹葉。和Dilatris 桑子L.
從新鮮的Dilatris組織分泌腔
Haemodoraceae、 Strelitziaceae、 科類、 芭蕉科植物家庭共同有次生代謝產(chǎn)物，稱為 phenylphenalenones一組。屬Dilatris是 phenylphenalenones 的唯一已知擁有內(nèi)部分泌腔 （SC），其略帶紅色的顏色建議在場的 Haemodoraceae 家庭的成員。使用研磨方法淺表 SC 提取盾狀腺毛的唇形的一些成員已成功；不過準確地從周圍的組織，從而使它們的內(nèi)容的植物化學成分分析分離 SC 的內(nèi)部供應鏈的外科解剖帶來新的挑戰(zhàn)
(A） 在第一種方法，新鮮的葉子， d。pillansii被切成小塊，然后被嵌在組織凍結媒體和液態(tài)氮冷凍的管理單元。作為有機溶劑的化學脫水植物組織中的石蠟包埋的過程，和使用這可以損害 LMD 樣品完全失去了 SC 的橙色彩色內(nèi)容的結果，超低溫 (在攝氏-25 o C） 被認為更適當為 LMD 準備組織樣本。冷凍的葉碎片是用切片機切和被安置在一張幻燈片上。
(B） 厚度的 60 μ m 被證明是最好的解剖腺上皮細胞的 SC 和其分泌的存儲空間。在一個單一的運行的激光很多時候?qū)崿F(xiàn)這一點。只有少數(shù)幾例觀察泄漏和這些 SC 因此而被丟棄。高粘度的植物化學成分含量的 SC 固定，后者到玻璃幻燈片。25 孤立的 SC 因此被鋒利的解剖針體視顯微鏡下的玻璃幻燈片從挑選。
(C） 術后樣本治療包括提取丙酮： 水 （20： 1） 與次生代謝產(chǎn)物的混合物和去除細胞碎片用離心機。上清液直接轉(zhuǎn)移到新鮮的微細管，在氮氣下曬干。
(D)殘留進行了再在氘代溶劑中溶解和分析反相液相色譜法和低溫1H 核磁共振 （NMR） 技術。比較確定了兩個主要和次要的 phenylphenalenone1H 核磁共振譜和 LMD 樣品的高效液相色譜-與參考化合物。檢測到 phenylphenalenones 的相對比例積分的比例所選擇確定1H NMR 信號。糖苷 phenylphenalenones 沒有建議 SC 是親脂性的隔間。
從Dilatris 植物標本室組織分泌腔
我們開發(fā)了一種新的方法來解剖 180 歲 SC 的葉子和內(nèi)、 外花被片在標本 （專為D.桑子和D.銅錘標本)。作為從D.反對在新鮮葉片的材料的供應鏈pillansii、 植物標本室材料的 SC 未涵蓋的周圍異構細胞從所有兩側(cè)
(A） A 專門制造金屬框架結合允許修復 SC 位于整個樣品的薄玻璃片。
(B） 二十 SC 收獲了使用 LMD。
(C） 觀察神經(jīng)纖維材料的收集使用重力微管的蓋子，然后直接轉(zhuǎn)給了核磁共振管不離心。
(D） 增加了 Deuterated 溶劑和混合了造影 1 分鐘。采用低溫提取的植物代謝物測定1H 核磁共振波譜法。一個 phenylphenalenone 被確定比較1H 核磁共振譜與那些正宗的參考。Phenylphenalenone 在 SC 的這兩個新鮮植物材料和超過 180 歲標本的檢測證明了這種植物次生代謝物的長期穩(wěn)定性。
LMD 作為一種工具來探索挪威云杉（歐洲云杉)樹皮的植物化學組分
石細胞
挪威云杉（歐洲云杉）是最豐富的針葉樹物種在歐亞大陸的北方和溫帶森林。這種生態(tài)和經(jīng)濟的重要康年綜合數(shù)組的化學防御化合物，如松脂、 單聲道、 倍半和二萜類化合物和多元酚類物質(zhì)，作為植物次生代謝產(chǎn)物參與防御病原體和草食動物包括苯乙烯、 苯丙素類、 黃酮類化合物的粘性混合物。很多的出版物處理過的防衛(wèi)作用的松脂少也，以解決多酚，這是由 Schiebe et al. 調(diào)查的焦點的作用。LMD 和低溫核磁共振波譜法的組合被用于石細胞 (石細胞) 挪威云杉樹皮 （圖 1） 中的微量化學分析。兩種酚類化合物，二苯乙烯 astringin 和黃烷酮醇 dihydroxyquercetin 3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷被確定的核磁共振譜的提取與那些引用和 MS 數(shù)據(jù)的比較.
(A)樹皮塊取樣從不同高度 （5 米、 15 米和 20 米） 的樹木在室外生長。一個新鮮的剃須刀片用于切割材料縱向在離地面 1.5 米的高度。冰冷卻帶被運送到實驗室和嵌入在組織冰凍介質(zhì)和立即用液態(tài)氮冷凍，然后保持在-20 ° c。碎片然后在-20 ° C 到 30 毫米厚片 cryosectioned，安裝在標準的顯微鏡載玻片，朝下節(jié)把它們放在一個徠卡 AS LMD 系統(tǒng)上。
(B)石細胞能從周圍的韌皮部細胞熒光模式排放 515 nm dicroic 鏡子 510 nm 勵磁 450 — — 490 nm） 的區(qū)別。激光觀察神經(jīng)纖維材料收集中的微量離心管帽的重力。兩到三天有必要，每個樣本的消費稅。多余冷凍介質(zhì)存在排除在外的石細胞向邊緣部分的集合。后 2 h 的收集，微細管已從 LMD 系統(tǒng)，避免過度變暖的采集的植物材料通過顯微鏡燈。
(C)離心法微圓管內(nèi)允許使用的材料在容器的底部上定居。在含硅凝膠在黑暗中在 4 o C 48 小時的薄層色譜法儲罐進行了物料的干燥。溫和條件提供徹底干燥，并最小化殘差 HDO 信號中的核磁共振譜。
(D)提取被執(zhí)行在核磁共振管中，向其中添加的植物材料和氘代的甲醇和緊接其后的造影為 5 分鐘1H-NMR，1H-1H 舒適和 HSQC 譜錄得兩種酚類化合物的測定 （astringin 和 dihydroxyquercetin 3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，如上文所述）。蘆丁是作為一種內(nèi)部的標準用于定量使用的兩種酚類化合物的分析1H 核磁共振。
圖 1： 流程圖突出聯(lián)合的激光顯微切割技術 （LMD）/NMR/MS 議定書 （修改后） 的關鍵步驟。施普林格科學 + 商業(yè)媒體的善良許可： 李 S-H 施耐德 B Gershenzon j： 微量化學分析、 激光觀察神經(jīng)纖維石細胞的低溫核磁共振波譜的挪威云杉。Planta 225 （3）： 771 — — 79 （2007 年） ；doi: 10.1007/s00425-006-0376年-z。
韌皮部薄壁細胞
雖然成熟挪威云杉樹木經(jīng)常被殺害，由樹皮甲蟲齒小蠹和其相關聯(lián)的藍染真菌，長喙殼 polonica，某些基因型的這針葉樹是更耐樹皮甲蟲或其真菌比其他關聯(lián)。專門的韌皮部細胞的挪威云杉樹皮的膨脹和改變他們植物化學成分的含量，對攻擊的樹皮甲蟲和其微生物副教授。結合 LMD1H NMR 被用來比較正常的韌皮部薄壁細胞和韌皮部薄壁細胞感染C.polonica從挪威云杉 （圖 2） 的干樹皮的植物化學成分含量.
(A)樹皮塊從正常控制和受感染的韌皮部薄壁細胞從同一棵樹上被收集和存儲在使用前 –80 o C。樣品被嵌入在組織凍存培養(yǎng)基，管理單元冷凍在液氮和 cryosectioned 成 40 μ m 厚片。
(B)激光顯微切割技術是徠卡 LMD6000 系統(tǒng)上執(zhí)行。在C.polonica-感染樣品，感染細胞本身不被收集，但細胞的感染網(wǎng)站旁邊被選為分析。兩個健康層的韌皮部薄壁細胞間的細胞層作為源用于篩胞。耗時集合所需的每個樣本的 3 — — 5 h。每個管的植物材料的收集時間只限于 1 — — 2 h，以避免樣品材料升溫。
(C)無形的肉眼，樣品被不干燥和直接用氘代甲醇提取和轉(zhuǎn)移到核磁共振管。
(D) 1H-NMR 譜提取的立即記錄并與酚醛引用比較。二苯乙烯苷 astringin 被證明是位于韌皮部薄壁細胞的主要次生代謝產(chǎn)物，在相鄰篩細胞顯著較低的濃度。黃酮 (+)-兒茶素在韌皮部薄壁細胞后出現(xiàn)感染的C.polonica，雖然減少了 astringin 的水平，相比，在非感染細胞。
圖 2： 激光顯微切割技術 （LMD） 多酚類薄壁組織和篩細胞從挪威云杉樹皮的部分。顯微照片顯示節(jié)之前和之后 LMD （規(guī)模酒吧： 50 毫米），和在集合帽切 （規(guī)模酒吧： 200 毫米）。R = 射線薄壁細胞，S = 篩胞，PP = 多酚薄壁細胞 （修改后）。轉(zhuǎn)載許可李 S-H et al.從： 挪威云杉（歐洲云杉）韌皮部薄壁細胞中酚類化合物的本地化。ChemBioChem 13： 2707年 — — 13 （2012 年）。版權所有 ? 2012年威里 VCH 出版社 GmbH & Weinheim 有限公司 KGaA。
LMD 作為一種工具，調(diào)查中黑暗和半透明腺金絲桃屬植物物種的代謝配置文件
貫葉連翹，通常稱為圣約翰草是全球暢銷的藥用植物之一。輕度到中度的抑郁可以有效治療，與對照臨床試驗證明這種植物地上部分的籌備工作。黃酮類化合物、 呫噸酮、 生物類黃酮、 等其它尤其是異戊烯基 phloroglucinols 貫葉金絲桃素和 adhyperforin 等都是由屬金絲桃屬植物的 Hypericaceae 的成員產(chǎn)生的主要植物次生代謝產(chǎn)物植物家庭。這些化合物都被本地化的多細胞，球狀或隧道狀聚合等分泌道和黑暗和半透明的腺體。我們選擇了現(xiàn)代技術的結合： LMD 和矩陣無紫外激光解吸電離 — — 大規(guī)模光譜成像 （LDI MSI） 和經(jīng)典的方法： 提取的整株植物材料使用的有機溶劑，來隔離并識別高度本地化的 UV 吸收化合物.
(A)以消費稅的黑暗和半透明的腺體，萼片和花瓣的H.貫葉連翹和H.reflexum，從這些固定之間薄玻璃片和一個特制的金屬框架 — — 習慣關長 SC Dilatris屬，如上文所述的過程類似。
(B)從花瓣深色的腺體和從黑暗和半透明腺體的夾層葉進行氮固態(tài)激光器的徠卡 LMD6000 系統(tǒng)。
(C)收集的腺體簡要離心和甲醇被加入到微圓管內(nèi)。
(D)后短暫的超聲波，整除數(shù)的個別樣品溶液被轉(zhuǎn)移到 MALDI 板和干果上他們 LDI-質(zhì)譜調(diào)查。沒有矩陣的電離是必要的可能是因為較強的紫外吸收植物次生代謝物的。激光微解剖深色的腺體的花瓣，黑色結節(jié)和樹葉的半透明腺體的 LDI-質(zhì)譜分析揭示了存在的不同植物化學成分的簡介等其它、 黃酮類化合物及 phloroglucinols 在不同本地化的腺體。
LMD 作為一種工具來研究防御次生代謝產(chǎn)物在盾狀腺毛的Colquhounia 黑老虎變種翅果油樹
東南亞國家屬Colquhounia從唇形植物家庭是一個 colquhounoids A — — C，一類新的 C 的一個特殊群體的來源25萜類化合物，含有。葉、 芽和這種植物的莖是由一層致密的眾多無腺毛狀體和盾形和頭狀腺毛狀體覆蓋。LMD 和 ultraperformance 液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜 （UPLC/MS） 的組合被用于分析的盾狀腺毛狀體 （圖 3） 的植物配置文件.
圖 3： 分析平臺的單個細胞水平定在中國科學院昆明植物研究所植物次生代謝物。
(A)的C.黑老虎變種翅果油樹剛收割的葉子被固定到一個特制的金屬框架上。
(B)裝入幻燈片上徠卡 LMD7000 系統(tǒng)具腺毛狀體后觀察神經(jīng)纖維，在一個微圓管內(nèi)收集了 500 人。
(C) 3,000 g，4 o C 3 分） 的短暫離心沉到了水底管的腺毛。提取方法，增加了丙酮和小瓶造影在 4 o C 的 10 分鐘。
(D)與 UPLC/MS 分析然后了上清液。三個主要的化合物： colquhounoids A — — C，也有從整個葉片材料從C.黑老虎變種翅果油樹和毫不含糊地確定的核磁共振和 x 射線衍射的甲醇提取物中分離，被發(fā)現(xiàn)在總離子色譜保留與時代 25.4、 28.9 和 23.7 min 和積極 ESI 質(zhì)譜與分子量的 430 中、 432、 448，分別 （圖 4）。
圖 4： C。黑老虎變種翅果油樹植物在綻放，（B 和 C） 的盾形和頭狀腺毛在葉背面上，盾狀腺毛與激光顯微切割技術，觀察神經(jīng)纖維盾狀腺毛與 UPLC/MS/MS （修改后） 中次生代謝產(chǎn)物 （G — — J） 微型化學分析 （D — — F） 集合。轉(zhuǎn)載從組織架構 Lett 許可。15： 1694年 — — 98 (2013 年)。版權所有 2013年美國化學學會。
LMD 作為一種工具，揭示不同油菜 （甘藍型油菜L.） 組織中次生代謝產(chǎn)物的分布模式
油菜（甘藍型油菜）是種植用于生產(chǎn)生物柴油、 動物飼料和植物油用于人類消費。由這個主要產(chǎn)油作物提供的全球石油生產(chǎn)的重要組成部分 （15%）。脂類的主要存儲站點是種子的胚。主要次生代謝物的甘藍型油菜種子是硫代葡萄糖甙和酚膽堿酯類。雖然這些次生代謝產(chǎn)物有腥味屬性，但他們是非常重要的生態(tài)價值的生物和非生物的相互作用的油菜[。LMD 應用四個組織的各部分 （下胚軸和胚根、 子葉內(nèi)在、 外在子葉和種皮和胚乳） 的甘藍型油菜種子從彼此使用 LMD
(A)成熟種子的甘藍型油菜垂直嵌入在組織凍存培養(yǎng)基，立即凍結在液態(tài)氮和 cryosectioned 成 60 μ m 厚片在使用冷凍切片的 –24 o C。
(B)節(jié)直接登上了對膜幀幻燈片和解剖使用徠卡 LMD6000 激光顯微切割系統(tǒng)。四個不同的組織部分先后解剖使用最強的激光強度和移動速度最慢的激光。材料的四個解剖組個別微細圓管內(nèi)收集了包括支持膜，被切割和收獲與植物材料的重力。
(C)觀察神經(jīng)纖維材料被然后轉(zhuǎn)移到高效液相色譜法小瓶和 1 毫升 80%（v/v) 甲醇被加入另外提取次生代謝產(chǎn)物在超聲波浴為 10 分鐘，白芥子苷 （10 μ M） 和肉桂酸膽堿酯類 （10 μ M） 被添加到內(nèi)部標準、 硫代葡萄糖苷，白芥子苷和肉桂酸膽堿酯類為芥子堿萃取液。硫代葡萄糖苷分離后從使用陰離子交換固相墨盒的其他化合物。
(D)非硫甙化合物的分析由 LC-女士 LC-爸爸/MS 用來分析芥子油苷在他們脫硫的形式通過與那些引用 MS 數(shù)據(jù)和保留時間的比較。結果表明硫代葡萄糖苷油菜成熟胚組織中均勻分布。均勻分布的芥子堿作為主導酚醛復合在油菜胚胎組織支持其倉庫功能。另外非硫代葡萄糖苷組分化合物如循環(huán)亞精胺復合物僅見于下胚軸和胚根和兩個黃酮類化合物主要是在子葉中找到。
LMD 作為一種工具，消費稅的************素分析的毛狀體
******是一種年度雌雄異株植物。它起源于東歐和中亞地區(qū)長期以來一直作為一個來源為傳統(tǒng)醫(yī)學栽培。負責C.苜蓿的生物活性化合物似乎是 phytocannabinoids，一個獨特的 terpenophenolics 擁有 alkylresorcinol 和單萜烯基群體。******素和精油生產(chǎn)的主要景點是毛狀體，特別是頭狀柄的腺毛。次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)大多是在最后五周的八個星期的總的開花周期期間。因此從周 7:56 上午在開花期的腺毛，由 LMD 收獲和******素配置文件由 LCMS 和低溫核磁共振法進行分析。
(A)的苞片和花被切成小片 （長度 0.2 — 0.5 厘米） 和固定在 4%磷酸緩沖甲醛，暴露 10 分鐘真空，一夜之間滲透在-4 ° C，然后安裝與鋼框架 （PET 膜，25 毫米 × 76 毫米） 幻燈片上的碎片.
(B)完好使用徠卡 LMD6000 顯微鏡解剖柄的頭狀的毛，元首和莖，以及作為完整的頭狀無梗毛。從每個樣本，25 — — 143 毛狀體被切除并收集的重力在離心管中。觀察神經(jīng)纖維材料當時 vortexed 為 1 分鐘，離心離心 5 min。為了避免脫羧基作用和退化的******素，解剖的樣本被存放在-20 ° C LMD 之后直接.
(C)為液相色譜-質(zhì)譜分析，60 μ L 甲醇被添加到每個觀察神經(jīng)纖維樣品從 4、 5、 6、 7、 和 8 個星期、 造影 10 分鐘和一夜之間在室溫下孵育。樣品，然后被稀釋在 H2O/甲醇 （2/1，v/v） + 0.1%甲酸溶液。對于低溫核磁共振測量，最低限度的氘代氯仿被添加到在 8 周收獲的解剖頭狀柄和頭狀無梗毛狀體。后發(fā)音為 1 分鐘，溶液轉(zhuǎn)移到核磁共振管的分析。
(D)液相色譜-質(zhì)譜和核磁共振數(shù)據(jù)確定 Δ9-tetrahydrocannabinolic 酸 （THCA） 和醇酸趙虹作為頭狀柄和頭狀無梗毛狀體的主要的化合物。液相色譜-質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)被用于的******素配置文件觀察神經(jīng)纖維毛狀體收集過去 5 周的生長周期的比較研究。結果表明： 質(zhì)的相似性的調(diào)查樣本。THCA，業(yè)內(nèi)，cannabigerolic 酸 (CBGA) Δ9-四氫******酚，cannabidiol 和 cannbigerol 被確定在所有樣品中開花階段。Cannabichromene 和******酚檢測作為次要化合物僅在完整柄的頭狀毛狀體的樣品和他們的頭在 8 周收獲。
結論
目前我們的基于 LMD 的出版物概要顯示廣闊的多樣性的植物材料，可以準備獲得本地化的植物化學信息在細胞水平 （葉、 莖、 花和種子材料的不同物種從不同植物的家庭）。基于 LMD 的化學分析可以揭示不均勻和植物發(fā)育階段依賴特殊組織中次生代謝產(chǎn)物的積累。因此程序可用于確定不同的、 依賴于器官的生物功能的次生代謝產(chǎn)物。此外有關代謝產(chǎn)物的特定的本地化信息可能有用來研究生物合成途徑、 代謝產(chǎn)物的改性和其濃度的調(diào)節(jié)。不同植物材料制備方法為 LMD 的如樣品材料專門制造的幻燈片系統(tǒng)中直接使用或嵌入的樣品材料之前給出了材料的透射。然而，我們是樣品的意識到挑戰(zhàn)制訂修改的或新的分析戰(zhàn)略，為每個新的制備。進一步改進領域的分析方法可以最小化成功識別所需的資料。因此可以允許這些難隔離材料樣品的研究減少工作負荷來分析這類組織和化合物。
鳴謝
我們感謝亞歷山德拉 zum Felde 編輯的幫助。作者非常感謝 Daniel Veit LMD 為構建特殊的幻燈片。