尼康顯微鏡FRET熒光蛋白
熒光蛋白越來(lái)越多地被作為非侵入性探針在活的，由于他們有能力進(jìn)行基因融合到有關(guān)蛋白質(zhì)的本地化，運(yùn)輸和動(dòng)力學(xué)研究細(xì)胞應(yīng)用。 此外，熒光蛋白的光譜特性是理想的測(cè)量使用福斯特的技術(shù)（或熒光）共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）顯微鏡細(xì)胞內(nèi)分子相互作用的可能性。 因?yàn)槟芰哭D(zhuǎn)移被限制為小于10納米的距離，F(xiàn)RET的檢測(cè)提供了關(guān)于融合蛋白的亞分辨率尺度的空間關(guān)系的有價(jià)值的信息。 這種互動(dòng)式教學(xué)探討熒光蛋白作為潛在的熒光共振能量轉(zhuǎn)移伙伴的各種組合，并提供有關(guān)關(guān)鍵的共振能量轉(zhuǎn)移參數(shù)，以及用于顯微鏡的光學(xué)過(guò)濾器的建議和光源配置信息。
教程初始化在廣角模式與當(dāng)前流行的FRET對(duì)的吸收和熒光發(fā)射光譜，增強(qiáng)型青色和黃色熒光蛋白（ECFP，標(biāo)記的供體 ;和EYFP，標(biāo)記的受體 ）中出現(xiàn)的光譜信息窗口疊加在發(fā)射光譜的汞弧放電燈（藍(lán)色線譜）。 供體發(fā)射光譜和受體的吸收光譜之間的光譜重疊區(qū)域被示為具有垂直線，并顯示在窗口下方的黃色框中的百分比。 同樣，吸收光譜重疊（ABOL）和發(fā)射光譜重疊（ 易美 ）區(qū)域中的紅色和藍(lán)色，分別示出，并且也顯示為百分比。 福斯特距離 （如下文所述計(jì)算），提出以納米為每個(gè)FRET對(duì)和上面的應(yīng)用預(yù)置按鈕顯示。 在本教程中，各種捐助的蛋白質(zhì)可以選擇出現(xiàn)在通道1和受體蛋白的出現(xiàn)在通道2的吸收和發(fā)射*大值列出每個(gè)通道和紅外光譜分析法或整個(gè)通道可以打開或關(guān)閉使用復(fù)選框。
為了操作的教程，選擇的成像模式（ 廣角或共焦 ），然后使用選擇的光源下拉菜單中選擇合適的照明光源（弧光燈或激光），然后疊加在供體和受體譜。 接下來(lái)，點(diǎn)擊應(yīng)用預(yù)置按鈕，激活提示的激發(fā)和發(fā)射帶通濾波器，以及在二色鏡所選FRET對(duì)（ 注：這些值僅作為一個(gè)起點(diǎn)確定一個(gè)有用的過(guò)濾器組合 ）。 該濾波器的通帶區(qū)域可以通過(guò)平移滑塊或點(diǎn)擊箭頭按鈕對(duì)在滑塊的兩端進(jìn)行調(diào)整。 左側(cè)的箭頭按鈕對(duì)移動(dòng)整個(gè)通帶，而右側(cè)的箭頭按鈕對(duì)調(diào)節(jié)寬度。 過(guò)濾器可以暫時(shí)從窗口中取消相應(yīng)的復(fù)選框（ES）中刪除。 該二色鏡滑塊可用于調(diào)整該光學(xué)元件的截止波長(zhǎng)。 吸收光譜 ， 發(fā)射光譜 ， 激發(fā)光源 ，和/或二色鏡可打開和關(guān)閉與該教程的右側(cè)的復(fù)選框。 通過(guò)捐助方和切換受體使用選擇供體 ，并選擇一個(gè)接受器下拉菜單時(shí)，使用維護(hù)狀態(tài)復(fù)選框凍結(jié)所有設(shè)置。 熒光蛋白的光譜類（藍(lán)色，青色，綠色，黃色和橙色/紅色）在這些菜單列出可以使用單選按鈕在本教程的上右上角選擇。
在本教程中所示的光譜曲線進(jìn)行了要么聚集了來(lái)自文獻(xiàn)或在使用純化熒光蛋白控制的條件下認(rèn)真記錄。 它們被歸為比較和顯示的目的。 在實(shí)際的FRET調(diào)查，光譜曲線可能會(huì)有所不同，由于在消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，探針的濃度，并為各種細(xì)胞器和活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的局部環(huán)境中的*大峰值的值的波動(dòng)。 因此，在本教程中所提供的信息應(yīng)被視為被設(shè)計(jì)僅用于教學(xué)目的。 此外，通過(guò)本教程的計(jì)算福斯特距離也是基于熒光蛋白的出版光譜參數(shù)（消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，波長(zhǎng)分布），并與其他文獻(xiàn)值普遍同意。 然而，根據(jù)使用來(lái)計(jì)算的FRET效率的變量，這些值可能不同于在一個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)定觀察。
一本教程的目標(biāo)目的是為了讓游客，探索*佳的照明光源和濾光片組合的具體FRET對(duì)。 例如，研究新的青色熒光蛋白，如綠，艾希青色（MiCy）時(shí)，該教程是檢驗(yàn)其在紫色線和藍(lán)色紫色光譜區(qū)（405到473納米），以確定*大激發(fā)效率激光器有用此探測(cè)器。 同樣，各個(gè)電弧放電燈（水銀，氙和金屬鹵化物）的光譜可以被疊加在供體的吸收光譜相匹配的激發(fā)濾波器帶寬和波長(zhǎng)分布，可能是容易在實(shí)驗(yàn)室。 本教程也是有效的確定大致的激發(fā)和發(fā)射光譜擴(kuò)散到水平的新探頭的組合，而如果過(guò)多，可能會(huì)在定量分析出現(xiàn)問(wèn)題。
當(dāng)熒光蛋白進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，由于通過(guò)激光或強(qiáng)烈的弧光燈的等離子體源照明，在分子表現(xiàn)為一個(gè)振蕩偶極子，并創(chuàng)建特征電場(chǎng)。 在情況下，一個(gè)合適的受體熒光蛋白（或其它熒光團(tuán)）的接近由興奮蛋白（供體）中產(chǎn)生的電場(chǎng)的邊界內(nèi)放置它，能量可以直接被誘導(dǎo)躍遷電動(dòng)相互作用傳送來(lái)自供體在受體。 中間的光子不參與。 能量轉(zhuǎn)移的效率是依賴于供體的電場(chǎng)幅度的平方，并且這個(gè)字段衰變作為供體和受體之間的距離的倒數(shù)第六功率。 福斯特距離表示分子分離在其中能量傳輸是50％的有效率。 對(duì)于發(fā)生可測(cè)量的煩惱，幾個(gè)要求必須得到滿足。 其中一個(gè)是對(duì)供體和受體熒光基團(tuán)，它僅限于幾個(gè)納米之間的物理距離很強(qiáng)的依賴性。 此外，必須有與受體的吸收光譜的供體發(fā)射光譜的顯著光譜重疊。 *后，無(wú)論是供體和受體分子必須在一個(gè)有利的相互取向。
在共振能量轉(zhuǎn)移的實(shí)際應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)生物學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵步驟是在福斯特距離（RO）的價(jià)值為目標(biāo)施主-受主對(duì)的計(jì)算。在此計(jì)算中的*重要因素是重疊積分（j（λ）），供體的量子產(chǎn)率在無(wú)受體（Q（d）段），和兩分子之間的取向因子（κ;這個(gè)變量的平方）。 在本教程中，重疊積分是根據(jù)公式計(jì)算：
其中，消光系數(shù)（ε（λ））被表示為每厘米，波長(zhǎng)以納米，并且給體作為波長(zhǎng)的函數(shù)的歸一化熒光強(qiáng)度倒數(shù)摩爾的單位是無(wú)量綱的。 重疊積分計(jì)算取決于許多變量，包括在熒光發(fā)射光譜曲線和供體的量子產(chǎn)率的環(huán)境影響。 對(duì)于具有高量子產(chǎn)率和受體具有大消光系數(shù)供體，該光譜重疊積分會(huì)更大，導(dǎo)致更有效的FRET伙伴具有較高滾裝值。 雖然折射率不發(fā)生變化，以典型的水性溶劑或蛋白質(zhì)之間有很大程度，在福斯特距離計(jì)算該參數(shù)顯示為第四功率的倒數(shù)，甚至相對(duì)微小的變化可以呈現(xiàn)更大的效果比量子產(chǎn)率或重疊積分。 此外，供體和受體之間的偶極 - 偶極相互作用的效率取決于兩個(gè)偶極子的取向。 取向因子，它描述了這樣的接近，范圍從0（兩個(gè)偶極子垂直）到4（偶極子平行）。 在一般情況下，該偶極子被認(rèn)為是快速移動(dòng)的時(shí)間尺度類似于供體激發(fā)態(tài)壽命，因而取向被描述為隨機(jī)的，具有0.67的取向因子（在本教程適用）。 請(qǐng)注意，取向因子近似可導(dǎo)致不確定性分離的基礎(chǔ)上的FRET結(jié)果在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)熒光基團(tuán)的距離的估計(jì)。