尼康顯微鏡拉姆達(dá)堆積和光譜特征

 類似的概念來(lái)使用的激光掃描共聚焦或解卷 積顯微術(shù)高數(shù)值孔徑物鏡較厚的標(biāo)本中獲得的光學(xué)部分 （ 或 z棧）中，lambda堆棧的三維數(shù)據(jù)集，它由使用相同的試樣場(chǎng)的圖像采集在不同的波長(zhǎng)帶，每一個(gè)橫跨有限的光譜區(qū)域范圍從2到20納米的獲取。 相反，在各種形式的光學(xué)顯微鏡的典型成像方案涉及在檢測(cè)器的整個(gè)波長(zhǎng)響應(yīng)頻帶獲取單個(gè)圖像（或一個(gè)連續(xù)組中的延時(shí)實(shí)驗(yàn)圖像）。 本教程探討一個(gè)lambda棧的頻譜分量。 

本教程初始化與包含從沾滿EGFP的Alexa Fluor 488和SYTOX綠色出現(xiàn)在光譜窗口原子核捕獲一個(gè)lambda堆棧中的各個(gè)光譜范圍。 下方的光譜是單核的偽彩色圖像，因?yàn)樗霈F(xiàn)的每個(gè)10納米的波長(zhǎng)頻帶中，具有發(fā)光強(qiáng)度是成正比的熒光基團(tuán)的存在量。 混合光譜的圖像呈現(xiàn)在本教程的右下角的角落。 為了操作的教程，使用LAMBDA堆棧段滑塊通過(guò)各個(gè)波段翻譯，觀察混合后的圖像，以及在光譜圖中顯示的強(qiáng)度比例。 一種新的熒光團(tuán)（青色，綠色或橙色）可以與光譜輪廓下拉菜單中進(jìn)行選擇。

為了測(cè)量吸收染料，熒光基團(tuán)，或者與多個(gè)標(biāo)簽完成試樣的光譜，透射或發(fā)射的光被*分散成它的組成部分的波長(zhǎng)和強(qiáng)度的各波長(zhǎng)的波長(zhǎng)或很窄的頻帶進(jìn)行測(cè)量。 光譜分辨率是依賴于每次測(cè)量的帶寬，并增加作為采樣通道decreses的帶寬。 多種不同的技術(shù)可用于分散光，并且其中大多數(shù)已被施加的（至少在原型儀器）于顯微鏡的情況。 其中當(dāng)測(cè)量光譜分辨率，波長(zhǎng)范圍和動(dòng)態(tài)范圍要考慮的*重要的特征。 光譜分辨率是由可以彼此區(qū)分開(kāi)來(lái)，并且是高度精確的光譜成像測(cè)量的關(guān)鍵參數(shù)*接近的波長(zhǎng)來(lái)確定。 光譜范圍是指波長(zhǎng)的總數(shù)（實(shí)際上，帶寬）在一個(gè)特定的測(cè)量。 *后，檢測(cè)限和動(dòng)態(tài)范圍定義必要的信號(hào)的*低水平進(jìn)行測(cè)量和區(qū)分的等級(jí)數(shù)在一個(gè)特定的測(cè)量，分別。 所有這些值可以改變每個(gè)熒光團(tuán)或吸光物質(zhì)的光譜曲線的函數(shù)。

圖1所示是一個(gè)典型的組中的6納米跨越500至692納米的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，以產(chǎn)生含有32幅圖像的lambda棧（在下面詳細(xì)討論）的順序獲得的帶寬光譜圖像。 該標(biāo)本是貼壁人宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞系）細(xì)胞中的DNA和RNA用吖啶橙染色及成像與尼康A(chǔ)1光譜共焦顯微鏡系統(tǒng)的文化。 圖像（512×512像素）采用32通道多陽(yáng)極光電倍增管以每秒24幀采用488納米激光激發(fā)的記錄。 如此高的采集速度，這是顯著益處在活細(xì)胞成像，通過(guò)*的信號(hào)處理技術(shù)，加上快速模擬 - 數(shù)字轉(zhuǎn)換電路，其操作以配合光電倍增管成為可能。