奧林巴斯顯微鏡熒光探針的激發(fā)效率

 一個熒光團(tuán)的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜分布是兩個必須在激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用選擇探頭時進(jìn)行審議的*重要的標(biāo)準(zhǔn)。 除了吸收和發(fā)射帶的波長范圍內(nèi)，摩爾消光系數(shù)為吸收和量子產(chǎn)率的熒光發(fā)射應(yīng)予以考慮。 在激光激發(fā)水平不飽和的熒光團(tuán)，熒光強(qiáng)度成正比的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率的產(chǎn)物。 這種互動式教學(xué)探討如何這種關(guān)系可以被用來與特定的激光共聚焦顯微鏡熒光相匹配。

本教程初始化與光譜波長與相對強(qiáng)度的情節(jié)出現(xiàn)在窗口，并在圖形上顯示一個隨機(jī)選擇的熒光團(tuán)的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜圖。 疊加在熒光激發(fā)光譜是*接近常見的共聚焦激光譜線來的染料的*大吸收的中央。 在這個波長，熒光發(fā)射在理論上是可能的*接近的*高值與所述激光，并在教程的熒光發(fā)射曲線包含在由熒光團(tuán)的消光系數(shù)的乘積和的發(fā)光強(qiáng)度所允許的強(qiáng)度的電平指示的色彩頻譜的填充。 在窗口下部的左角的發(fā)光強(qiáng)度框呈現(xiàn)在*大波長與熒光發(fā)射*密切相關(guān)的顏色。

為了操作的教程，使用波長滑塊來調(diào)整激光的選擇了由熒光團(tuán)的吸收光譜配置文件規(guī)定的區(qū)域。 滑塊被限制在一個范圍內(nèi)的光譜的端部，并且只能行駛到*近的激光線過去這些邊界。 作為虛擬激光線沿波長軸平移，教程計算出熒光團(tuán)的摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率的產(chǎn)物，并不斷更新所得到的值作為發(fā)光強(qiáng)度框下面的百分比，以提供相對熒光的定性測量發(fā)射，可以在相應(yīng)的激發(fā)波長可以預(yù)期的。 同樣地，顏色的強(qiáng)度顯示在排放強(qiáng)度框發(fā)生改變以反映熒光發(fā)射的在所選定的激光源激發(fā)波長的相對強(qiáng)度。 每個波長有關(guān)的激光源顯示在以上波長滑塊一個黃色的盒子，并從激光的特定譜線上方的滑塊顯示。 熒光類可以使用在窗口的右手側(cè)上的單選按鈕進(jìn)行選擇，個別的熒光團(tuán)可以用選擇的染料下拉菜單被加載到顯示圖形。

目前可用于共聚焦顯微鏡的熒光探針的數(shù)量在數(shù)百運(yùn)行時，與具有與普通激光譜線密切相關(guān)的*大吸收許多染料。 一個特定的激光線和*大吸收的特定探針之間的精確匹配并不總是可能的，但線的激發(fā)效率接近*大通常足以產(chǎn)生可容易檢測到的熒光發(fā)射的電平。 例如，在圖1中的兩種常見的探針的吸收光譜示出，隨著*高效激光激發(fā)線。 綠色光譜是異硫氰酸熒光素（FITC），它具有吸收*大值的495納米的吸收曲線。 的FITC熒光團(tuán)在488納米使用氬離子激光的激發(fā)產(chǎn)生約87％的發(fā)射效率。 與此相反，當(dāng)477納米或514納米的氬離子激光線被用來激發(fā)FITC，發(fā)光效率下降到僅58或28％，分別為。 顯然，在488納米的氬離子（或氪 - 氬）激光線是*有效的源此熒光團(tuán)的激發(fā)。

紅色光譜在圖1中是的Alexa Fluor 546，一個雙磺化脂環(huán)呫噸（若丹明）衍生物與在556納米，它是專門設(shè)計來顯示增加的量子效率在光漂白的水平顯著降低*大消光系數(shù)的吸收曲線熒光實(shí)驗(yàn)。 供的Alexa Fluor 546的*有效的激光激發(fā)光譜線是由氪 - 氬混合氣體離子激光器，其產(chǎn)生約84％的發(fā)光效率的黃色的568納米線。下一個*接近的激光譜線，從綠氦氖激光器的543納米線和594納米的線條從黃色氦氖激光器，激發(fā)的Alexa Fluor 546與43的效率和4％，分別為。 請注意，488納米氬離子激光譜線激發(fā)的Alexa Fluor 546約7％的效率，一個因素進(jìn)行雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，同時FITC和Alexa Fluor 546的時候，可以關(guān)注。