徠卡顯微鏡了解腎臟疾病和體內(nèi)再生的動(dòng)態(tài)過程
腎小球?yàn)V過屏障（GFB）是在腎臟glomerulis一個(gè)復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，其中*濾發(fā)生。 足細(xì)胞是GFB的關(guān)鍵因素，并參加在過濾過程。 它們已顯示出參與了腎臟疾病的發(fā)展。 然而，由于技術(shù)限制，腎小球病變的機(jī)理還不是很清楚。 亞諾什PETI-Peterdi的研究小組在美國(guó)南加州大學(xué)開發(fā)出一種稱為串行多光子顯微鏡（MPM）的新方法，它允許跟蹤單個(gè)腎小球的命運(yùn)在幾天。 *近，它被公布為在自然醫(yī)學(xué)的封面故事 。 在這次采訪中，他對(duì)串行MPM如何影響他的研究意見。
你的論文做了它對(duì)自然醫(yī)學(xué)的扉頁(yè)。 所顯示的圖片，以及為什么它被選作封面？ 是什么使得它特別的/有趣嗎？
在封面頁(yè)顯示了生活小鼠腎臟的表面區(qū)域的視覺吸引力的，有代表性的多色彩圖像。 圖像被收購(gòu)?fù)ㄟ^使用新生成的轉(zhuǎn)基因小鼠，我們命名為podocin蛋白-五彩紙屑小鼠體內(nèi)多光子熒光成像。 鼠標(biāo)行單側(cè)輸尿管梗阻是腎臟纖維化的經(jīng)典，常用的模型。足細(xì)胞，一個(gè)在腎臟中*重要的細(xì)胞類型，其中的形式和維持腎小球過濾器，被標(biāo)記的四種顏色之一，基于基因編碼的膜定位的CFP（藍(lán)色）的細(xì)胞特異性表達(dá)，核GFP（綠色） ，胞漿YFP（黃色）或胞質(zhì)RFP（紅色）。 標(biāo)記的葡聚糖（等離子染料）照亮了腎血管。 這項(xiàng)新技術(shù)有助于識(shí)別和跟蹤相同的單足*過病程完整的活體腎移植的命運(yùn)。 這對(duì)于識(shí)別和跟蹤單足細(xì)胞未受影響腎臟的改進(jìn)方法可以提高我們的腎小球損傷和再生的機(jī)制的理解。 我們相信，這種方法的新穎性和重要性幫助這個(gè)形象，我們的報(bào)告使它的封面。
時(shí)間可能也有幫助。 這是該雜志十二月號(hào)，因此節(jié)日。 在血管樹的結(jié)尾多色標(biāo)記腎小球看起來像圣誕樹上的圣誕球。
請(qǐng)描述串行的MPM，你已經(jīng)開發(fā)方面的研究完好腎組織的方法。 它是如何工作的？
為了更好地理解足細(xì)胞遷移的動(dòng)態(tài)，我們?cè)谕暾男∈竽I臟在體內(nèi)發(fā)展同腎小球串行MPM成像隨著時(shí)間的推移，一旦每24小時(shí)。 串行MPM需要多個(gè)尚存，同樣的動(dòng)物的微創(chuàng)手術(shù)。 在麻醉小鼠左腎輕輕地從背側(cè)切口被很好的耐受性通過動(dòng)物相比傳統(tǒng)的腹側(cè)方法形象化和小鼠放置于加熱的顯微鏡載物臺(tái)，使用倒置顯微鏡MPM成像。 腎臟適于成像的區(qū)域被確定與腎臟的位置是注意到相同的位置上隨后的日子里。
獲得的Z-堆棧的腎小球后小遙遠(yuǎn)區(qū)域中的視場(chǎng)的特點(diǎn)是很快把激光束聚焦在具有高功率這個(gè)區(qū)域。 這個(gè)動(dòng)作產(chǎn)生一個(gè)容易找到的高熒光點(diǎn)（參考點(diǎn)），它在那里停留3-5天。 相對(duì)于感興趣的腎小球標(biāo)記的位置被記錄在案。 成像后，腎被放回腹膜后和側(cè)面切口關(guān)閉與縫合。 這個(gè)過程重復(fù)在同一動(dòng)物/腎小球24，48，72，等等小時(shí)后除去縫合線，并再次外縫合腎臟。 使用這種技術(shù)，我們能夠隨后找到被標(biāo)記在所述*成像會(huì)話的腎小球約70％。 收購(gòu)具有相同的成像設(shè)置為前一天的Z-堆棧標(biāo)記腎小球。
使用Leica TCS SP5的多光子共聚焦熒光成像系統(tǒng)，在860納米（相干）和徠卡DMI6000乙倒置顯微鏡的外部nondescanned由一個(gè)變色龍*二MP激光器63X徠卡甘油浸入式物鏡（NA 1.3）購(gòu)入的圖像探測(cè)器。 短通濾波器（680納米的藍(lán)色和紅色，700 nm的綠色和黃色），分色鏡（切斷在515 nm的綠色和黃色，560納米的藍(lán)色和紅色）和帶通濾波器是具體的檢測(cè)CFP / GFP / YFP / RFP發(fā)射（473納米/ 514納米/ 545納米/ 585納米）（色度）。
圖1：?jiǎn)巫慵?xì)胞未受影響腎臟podocin蛋白，五彩紙屑用鼠標(biāo)在體內(nèi)多光子熒光成像的識(shí)別和跟蹤。 腎小球毛細(xì)血管袢外足細(xì)胞被標(biāo)記的四種顏色之一，或者通過膜定位的CFP（藍(lán)色），核GFP（綠色），胞漿YFP（黃色）或細(xì)胞內(nèi)的RFP（紅色）。 標(biāo)記的葡聚糖（等離子染料，灰度）照亮了腎血管。
有什么困難呢？ 什么是新約的串行MPM？
腎小球?yàn)V過屏障（GFB）具有由幾種不同的細(xì)胞類型，包括特殊的間質(zhì)細(xì)胞稱為腎小球系膜細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，足細(xì)胞，并形成了一個(gè)非常復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的三維結(jié)構(gòu)。 足細(xì)胞是GFB，在腎小球毛細(xì)血管一個(gè)復(fù)雜的血管部，其血漿*濾的關(guān)鍵要素。 足細(xì)胞是高度分化形成圍繞毛細(xì)血管袢的外面長(zhǎng)的初級(jí)和次級(jí)的擴(kuò)展，包裹細(xì)胞。 它們的相互交叉的足突之間的狹縫狀光闌形成這是GFB的一個(gè)關(guān)鍵組成部分。 *近的基因和細(xì)胞生物學(xué)的研究強(qiáng)調(diào)了在腎小球疾病的發(fā)展足的極端重要性。 不過，在了解腎小球病理的機(jī)械細(xì)節(jié)的一個(gè)關(guān)鍵障礙一直是技術(shù)上的限制，研究GFB在其原生環(huán)境。 由于體內(nèi)缺乏數(shù)據(jù)，仍有顯著差距，我們的足細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和運(yùn)動(dòng)及其鏈接蛋白尿和腎小球硬化的理解。 然而，這種洞察力，將需要新的治療策略的發(fā)展。
高分辨率成像工具的應(yīng)用，尤其是該系列的MPM方法可以提供長(zhǎng)期失蹤的體內(nèi)技術(shù)足細(xì)胞研究。 MPM是一種***的，微創(chuàng)光學(xué)切片技術(shù)，它允許在小鼠腎臟包括體內(nèi)腎小球的成像。 串行MPM代表了一種新的技術(shù)進(jìn)步這使我們，對(duì)于*次，腎小球疾病的過程中，以可視化的完全相同的足細(xì)胞/腎小球區(qū)域（組織體積）在幾天的完整活腎。 沒有任何其他現(xiàn)有的技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)這一目標(biāo)。 優(yōu)點(diǎn)包括（i）克服腎小球異質(zhì)的問題，（ii）建立的動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞遷移，組織重塑和（iii）與功能性的測(cè)量相結(jié)合的圖案。
你是通過串行MPM取得哪些新的見解，你是不是能夠得到這樣呢？
串行MPM成像是有助的在描繪，*次，動(dòng)力學(xué)和腎小球形態(tài)學(xué)，細(xì)胞成分，并常在24小時(shí)之前的成像會(huì)議內(nèi)發(fā)生足細(xì)胞突起的巨大變化。 我們發(fā)現(xiàn)的證據(jù)，足細(xì)胞遠(yuǎn)離自己平時(shí)解剖位置的遷移，從腎小球一簇。 我們的數(shù)據(jù)支持高動(dòng)態(tài)（新范式），而不是靜態(tài)的性質(zhì)腎小球環(huán)境和細(xì)胞組成（目前教條）。 此外，一個(gè)新的解剖學(xué)發(fā)現(xiàn)是連接內(nèi)臟（足細(xì)胞）和頂葉皮層（胸肌）可能參與細(xì)胞 - 細(xì)胞通訊和細(xì)胞遷移的納米管的*可視化。
是如何串行MPM改變你的研究？
新型小鼠模型用熒光細(xì)胞譜系標(biāo)記序列的MPM是一種新型的，*設(shè)備，**的**的，成像的方法，我們將繼續(xù)利用我們的研究，直接和定量可視化在不同腎細(xì)胞類型的招聘和命運(yùn)體內(nèi)和解決它們的功能和作用在腎血管和腎小球重塑在健康和疾病。 到目前為止，我們已經(jīng)開發(fā)了幾種新的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，七種不同腎細(xì)胞類型可以由基因編碼的，多色熒光蛋白的表達(dá)特異性標(biāo)記。
與串行，活體成像的MPM技術(shù)突破相結(jié)合這一新的工具箱是一個(gè)巨大的技術(shù)進(jìn)步為我們的研究計(jì)劃，并允許我們，并會(huì)繼續(xù)讓我們來研究正常和病變的腎臟功能的動(dòng)態(tài)的活體腎在*的細(xì)節(jié)。 這種新技術(shù)的應(yīng)用使我們能夠產(chǎn)生幾個(gè)高度創(chuàng)新的理念和方法，包括新的，非傳統(tǒng)的機(jī)制和作用于許多不同腎細(xì)胞類型的鑒定和表征。
在干/祖細(xì)胞研究的新進(jìn)展帶來了新的視角和專注于組織再生和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域，包括腎臟和心血管（病理）生理細(xì)胞命運(yùn)的改變。 新穎的技術(shù)已經(jīng)成為可用的細(xì)胞系和不同器官單個(gè)細(xì)胞的命運(yùn)跟蹤的熒光標(biāo)記。 我們將利用這些***的研究工具，結(jié)合串行MPM來推進(jìn)我們的功能和腎功能的特定細(xì)胞類型（如致密斑的足細(xì)胞，細(xì)胞，腎素分泌細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞，毛細(xì)血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的命運(yùn)的理解，間充質(zhì)祖細(xì)胞，等等），它是腎和腎小球功能（如腎小球?yàn)V過，腎血流量，腎小管分泌和再吸收），腎素 - 血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵部件，并且還重要的參與者腎臟病理學(xué)的重要調(diào)節(jié)劑。
什么是方法的未來的可能性？
除了跟蹤細(xì)胞遷移和命運(yùn)變化，腎臟疾病中組織重塑的時(shí)間動(dòng)態(tài)的，我們可以使用串行MPM成像疾病的過程中了解的變化，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞 - 細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。 例如，小鼠足細(xì)胞中的基因編碼的鈣指示劑GCaMP3的細(xì)胞特異性表達(dá)系列MPM成像是*近成立在我們的實(shí)驗(yàn)室。 這種新方法使我們能夠腎小球硬化和腎纖維化的發(fā)展過程中定量可視化鈣升高的足細(xì)胞，并在腎小球?yàn)V過，血管通透性，與足細(xì)胞損傷和病理的傳播病理改變他們的致病作用。
說明體內(nèi)這種技術(shù)進(jìn)步，足細(xì)胞鈣成像的文件目前正在印刷中的臨床研究雜志。 與腎臟結(jié)構(gòu)和功能的串行MPM成像相結(jié)合，新穎的酶Cre /液氧為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因方法將幫助我們?cè)诮窈蟮墓ぷ髦刑貏e標(biāo)注，操作（消融）細(xì)胞在體內(nèi)的腎臟完好，敲出特定基因特別是在某些細(xì)胞類型（條件性敲除小鼠），并分析其在健康和疾病的腎功能和腎血管和腎小球重塑的作用。 使用未來的，不斷發(fā)展的成像技術(shù)和預(yù)期進(jìn)一步推活體的限制，許多腎細(xì)胞類型，包括足細(xì)胞的功能性成像方法（如長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅外激光，極敏感探測(cè)器，*分辨率納米顯微）。