尼康顯微鏡共振掃描激光共聚焦顯微鏡教程

 為了獲得往往需要通過(guò)活細(xì)胞成像的速度更快的時(shí)間尺度圖像，激光掃描共聚焦顯微鏡必須重新設(shè)計(jì)，以結(jié)合了*的掃描方案，使光束是光柵掃描以更高的速度穿過(guò)標(biāo)本。 為了克服傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡固有的速度慢，一些制造商已經(jīng)推出了搭載了能夠采集圖像以每秒或更高的30幀的共振掃描鏡儀器。

本教程由初始化顯示共振掃描儀像素時(shí)鐘激光束疊加在拉伸倫奇光柵（長(zhǎng)黑線）的余弦格局。下方的掃描圖案是通過(guò)光柵和掃描過(guò)程中所產(chǎn)生的像素時(shí)鐘計(jì)數(shù)傳送的光的強(qiáng)度。 該圖的左手側(cè)示出了正向掃描，而在右手側(cè)示出了在反向掃描。 注意，本教程的速度得到了大幅為了證明在共振掃描所發(fā)生的各種事件減少。 作為掃描的進(jìn)行，典型的標(biāo)本中示出的圖像掃描窗口。 水平掃描鏡的角度也被指示為是從相對(duì)于所述倫奇光柵的像素時(shí)鐘激光的反射光束的位置。 為了操作的教程，請(qǐng)單擊掃描圖片按鈕啟用手動(dòng)更改到X掃描和Y掃描滑塊。

由于非線性諧振掃描器速度，熒光樣品被掃描在中央?yún)^(qū)域中的*高速度，該速度逐漸減小的掃描到達(dá)邊緣。 作為一個(gè)結(jié)果，當(dāng)從一個(gè)諧振掃描器產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)流的獲取與一個(gè)圖像采集卡主頻為一個(gè)恒定的像素率（假定光束掃描線）時(shí)，圖像出現(xiàn)拉伸的邊緣。 此外，激光的激發(fā)強(qiáng)度（大于在邊緣處）的不均勻分布產(chǎn)生的，因?yàn)樵黾拥谋┞队诩す獾倪^(guò)多的光漂白（和潛在的光毒性）在掃描區(qū)域的邊緣。 用于補(bǔ)償掃描非線性的*簡(jiǎn)單的辦法是限制掃描范圍的那部分的振蕩周期，其中該檢流計(jì)的速度幾乎是線性的，這發(fā)生在跨越約70％的總的掃描寬度的一個(gè)區(qū)域。 不幸的是，這種解決方案減少的時(shí)間發(fā)射的信號(hào)可以被收集的量，增加掃描周轉(zhuǎn)時(shí)間之前信號(hào)可以被再次收集，并且不阻止在光漂白落在被記錄的區(qū)域以外的樣品的區(qū)域。光漂白的效果可以但是*小化，通過(guò)引入一個(gè)可調(diào)節(jié)孔，以限制暴露于光照樣品的區(qū)域使用檢流計(jì)振蕩的線性部分時(shí)。

誘導(dǎo)的非線性諧振振鏡掃描圖像失真是幸運(yùn)的可預(yù)測(cè)的和可使用軟件或硬件的解決方案被校正。 不論所涉及到產(chǎn)生圖像的校正方案的，*有效的掃描策略包括在檢流計(jì)鏡的正向和反向掃描采集數(shù)據(jù)。 前向掃描過(guò)程中記錄的數(shù)據(jù)是簡(jiǎn)單的，但是由于該反向掃描反轉(zhuǎn)，其中像素被記錄在方向上的事實(shí)，圖像數(shù)據(jù)必須使用專(zhuān)門(mén)的讀 - 寫(xiě)緩沖器或軟件被倒置。 在實(shí)踐中，圖像被聚集在普通寬度的兩倍（實(shí)際上，1024像素的*終圖像512×512像素大小）和一半的正常高度（256像素）。 在諧振電反射鏡的每個(gè)正向X軸掃描結(jié)束時(shí)，提供給線性（y）的電流計(jì)的垂直鋸齒波信號(hào)是由1行和反向（x）的掃描開(kāi)始遞增。 在這種方式下，垂直掃描順利的為256個(gè)周期，直到足夠的數(shù)據(jù)供一個(gè)圖像被獲取。

軟件和硬件時(shí)鐘的共振掃描共聚焦顯微鏡解決方案依賴于明知位置數(shù)據(jù)的高頻諧振電流鏡。于7.9千赫茲器件，該反射鏡可以在圍繞中心軸（總共24度的旋轉(zhuǎn)），每個(gè)方向旋轉(zhuǎn)約12度。鏡子的角位置（θ）和相位或速度（φ）的關(guān)系可以根據(jù)振蕩周期的狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測(cè)。 在一個(gè)振蕩周期的開(kāi)始（鏡位置等于正負(fù)12度，參見(jiàn)圖1）的反射鏡是固定的速度等于零。 作為反射鏡擺動(dòng)朝向中點(diǎn)，角速度隨著相位的余弦函數(shù)和達(dá)到*大時(shí)的反射鏡的角度為零。 繼續(xù)，反射鏡會(huì)減慢再在接近正向掃描的結(jié)束，直到它到達(dá)一個(gè)速度等于零，因?yàn)樗查g反轉(zhuǎn)方向。 在角速度相同的變化被觀察為在相反的方向上的反射鏡的旋轉(zhuǎn)。 應(yīng)當(dāng)考慮與諧振電流計(jì)的另一個(gè)因素是，這些設(shè)備是高Q值的振蕩器和不能有效地同步到一個(gè)外部頻率，由于在相位和時(shí)，即使*輕微的漂移的自然振頻率和外部之間發(fā)生振幅大的響應(yīng)變化驅(qū)動(dòng)源。 因此，諧振電流計(jì)本身應(yīng)被用來(lái)作為主振蕩器，而所有其它部件的定時(shí)是同步的。

對(duì)于諧振掃描共聚焦顯微鏡的基于軟件的時(shí)鐘方案涉及的算法，其能夠使用基于反射鏡的可預(yù)測(cè)的運(yùn)動(dòng)的查找表像素?cái)?shù)據(jù)線性化。 作為一個(gè)實(shí)例，一種流行的算法首先確定一個(gè)相位不變的鏡子和幀接收器，然后定位到*終圖像的中心像素。 該算法運(yùn)行周?chē)鷮?duì)稱(chēng)，其中反射鏡的位置是已知的具有高精確度的中心平面。 圖像是通過(guò)檢查一個(gè)水平掃描線在它們被輸送到幀抓取器一次處理。 像素?cái)?shù)據(jù)被存儲(chǔ)為從掃描儀在*終的圖像寬度的兩倍和一半的*終身高接收。 在這個(gè)過(guò)程的*步涉及從水平掃描行的第二半反相數(shù)據(jù)點(diǎn)，隨后交錯(cuò)的數(shù)據(jù)線之間的反碼數(shù)據(jù)的*圖像的一半（圖1（b））。 因?yàn)樵搱D像的中點(diǎn)可能不肯定地知道，由于收集數(shù)據(jù)，觸發(fā)采集的水平同步信號(hào)和開(kāi)始之間的時(shí)差，它往往是必要的軟件由幾個(gè)像素來(lái)抵消反相掃描線。 在這種情況下，掃描線的右邊緣，然后用作用于圖像的參考點(diǎn)。 序列中的下一個(gè)步驟是應(yīng)用一個(gè)校正因子為每個(gè)像素或相位位置相對(duì)于中心像素。 該象素，然后重新定位到*終圖像（圖1（c））的正確位置。 在理想情況下，利用*的高速計(jì)算機(jī)，輸入的數(shù)據(jù)可以在飛行中進(jìn)行分析和記錄實(shí)時(shí)硬盤(pán)。

在諧振電流計(jì)的水平掃描期間，定時(shí)寄存器光電二極管的激光的散射的倫奇光柵可以被電子地變換為具有可變頻率的像素時(shí)鐘脈沖。 這些光脈沖將更加頻繁的時(shí)間時(shí)，檢流計(jì)鏡處于其振蕩周期的中央部分，但由于反射鏡到達(dá)掃描結(jié)束和反轉(zhuǎn)方向就會(huì)慢下來(lái)。 其中所述光電二極管檢測(cè)器的要求是處理可變脈沖頻率（在帶寬方面），它必須足夠大，以檢測(cè)整個(gè)掃描線的能力。 該檢測(cè)器被連接到一個(gè)跨導(dǎo)放大器，轉(zhuǎn)換光電二極管的電流脈沖轉(zhuǎn)換成一個(gè)放大的電壓，然后將其饋送到一個(gè)加倍每行的像素?cái)?shù)的倍頻電路。 光電二極管和相關(guān)的電子器件提供256個(gè)脈沖，每行和倍頻電路將這個(gè)輸出到512個(gè)脈沖，每行是由一個(gè)幀抓取器獲得并用于構(gòu)建圖像。

示于圖2是基本概念的使用倫奇耦合到一個(gè)光電二極管檢測(cè)器光柵作為一個(gè)變量像素時(shí)鐘后面的圖示。 為清楚起見(jiàn)，在圖2所示的光柵（一）僅包含8疊加有來(lái)自諧振電流計(jì)隨時(shí)間變化的余弦波運(yùn)動(dòng)的一個(gè)完整的周期等于寬度的間隔（紅色曲線; 125微秒）。 實(shí)際光柵具有256線的間距，并且由于該像素時(shí)鐘激光實(shí)際上折回單行（垂直于不透明線）跨越在操作光柵表面（圖2（b））的事實(shí)更為緊湊的線性尺寸。 作為光束進(jìn)入和離開(kāi)倫奇的清晰區(qū)域光柵，是由光電二極管檢測(cè)到的上升和下降中的步驟與檢流計(jì)的運(yùn)動(dòng)（圖2（c））的透射光強(qiáng)度。 由光電二極管檢測(cè)到的光強(qiáng)度的每個(gè)過(guò)渡（在這種情況下，從暗到亮），用于生成像素時(shí)鐘（圖2（d）），通過(guò)在顯微鏡觸發(fā)圖像捕獲。 雖然在圖2（d）示出的時(shí)鐘脈沖的非均勻間隔的時(shí)間（從約70到160毫微秒），但是，它們分別對(duì)應(yīng)于圖像空間相等的間隔。

為了獲得象素取樣以相等的空間間隔（而不是在時(shí)間上相等增量），從主顯微鏡成像系統(tǒng)，光電倍增管的信號(hào)通過(guò)可變?cè)鲆娣糯笃鞯某Ｒ?guī)和偏移量，并且然后由一個(gè)模擬 - 數(shù)字轉(zhuǎn)換器進(jìn)行數(shù)字化觸發(fā)通過(guò)從倫奇光柵脈沖產(chǎn)生的像素時(shí)鐘。 然而，有一半的圖像信息的原因在于，在諧振電流計(jì)掃在兩個(gè)方向上的事實(shí)相反。 為了構(gòu)建一個(gè)圖像之前，以糾正這種雙向掃描神器，數(shù)字像素輸出被首先轉(zhuǎn)移到任何一個(gè)先入先出（FIFO）或后進(jìn)先出（LIFO），緩沖取決于是否從左至右或從右到左被收購(gòu)像素。 由此，檢流計(jì)鏡的水平掃描期間，即在產(chǎn)生的*掃掠（62.5微秒的時(shí)間段）的一半所獲取的圖像的像素被饋送到FIFO緩沖器，而在反向掃描期間所獲得的像素被饋送到后進(jìn)先出緩沖區(qū)。 FIFO緩沖器被讀出和復(fù)位到零在每個(gè)水平行采集的開(kāi)始，而后進(jìn)先出緩沖器中存儲(chǔ)輸入的數(shù)據(jù)，并隨后讀出期間向下計(jì)數(shù)，以確保在反向掃描期間所獲得的像素被反轉(zhuǎn)。