徠卡顯微鏡怎么脫鈣？
脫鈣描述的技術(shù)中用于除去從骨或其它組織鈣化礦物，使優(yōu)質(zhì)的石蠟切片，可以制備將保留所有必需的微觀元素。 脫鈣進(jìn)行后標(biāo)本已被徹底固定和前常規(guī)處理石蠟。 在本文中骨的基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行說(shuō)明，并在技術(shù)選擇用于制備章節(jié)中所述。 對(duì)于脫鈣和成功地監(jiān)測(cè)該過(guò)程的程序進(jìn)行了討論，并提供了一些流行的選擇試劑的選擇。
介紹
有一些當(dāng)組織學(xué)家是必需的，以產(chǎn)生從骨或其它鈣化標(biāo)本切片可用的選項(xiàng)。 在選擇技術(shù)和加工方法必須考慮到調(diào)查正在開(kāi)展的類型。 例如，如果骨代謝病已在調(diào)查中，必須從骨樣分化礦化骨，或者如果形態(tài)學(xué)測(cè)量是必需的，它可能有必要通過(guò)產(chǎn)生的“非脫鈣”骨部分，以保持和展示的礦物質(zhì)含量。 作為礦化骨是這樣的硬質(zhì)材料也有提供由它產(chǎn)生的部分的技術(shù)范圍有限。 固定后，它可以直接鋸成薄晶片，然后利用研磨磨料的表面，以產(chǎn)生薄的“接地”部分（參見(jiàn)圖1）。 另外，也可以通過(guò)與丙烯酸或環(huán)氧樹(shù)脂的聚合時(shí)，具有同等的礦化骨的硬度滲入他們準(zhǔn)備骨標(biāo)本。 然后，您可以從他們身上直接使用重型切片機(jī)（如徠卡SM2500）和碳化鎢或金剛石刀具（見(jiàn)圖2）的滲透標(biāo)本或部分產(chǎn)生接地部分。 礦化松質(zhì)骨的冰凍切片是另一種可能性。
圖1：密質(zhì)骨的未染色的地面部分。 許多骨單位（哈弗系統(tǒng)）被橫向切割。 該骨單位由骨（lamelle）的周邊包含血管的中央哈佛氏管同心層。 內(nèi)lamelle是空白（空格）通常含有骨細(xì)胞。在干燥的地面部分，如這一點(diǎn)，他們會(huì)顯示為黑色結(jié)構(gòu)，由于顆粒磨料和包含在其中的空氣。
圖2：松質(zhì)骨（馮·科薩）的非脫鈣部分。 骨固定在福爾馬林中，并進(jìn)行處理和嵌入在環(huán)氧樹(shù)脂用于切片。 鈣化骨是黑色的，因?yàn)槭枪撬璧牟考惞琴|(zhì)的骨小梁的表面上的邊緣被染成藍(lán)色。 需要注意的是，盡管聚合的樹(shù)脂的支持下，在這種情況下，基質(zhì)鈣化已經(jīng)準(zhǔn)備的一段期間破裂。
更常見(jiàn)的骨和其他鈣化標(biāo)本脫鈣（軟化水）以下的固定，并用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生的石蠟切片進(jìn)行處理。 脫鈣切片用于骨髓的檢查及腫瘤，感染或用于其它目的的診斷。 試樣可在髂嵴環(huán)鉆或骨片在操作（如股骨頭）除去或從截肢標(biāo)本解剖的表格。 精細(xì)的細(xì)節(jié)X光片通常用來(lái)協(xié)助適當(dāng)骨標(biāo)本進(jìn)行處理的選擇。 除了 在骨，其他組織可能經(jīng)歷與變性過(guò)程如壞死（營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化）相關(guān)聯(lián)的鈣化或它可能發(fā)生在血管壁或在腎，肺或其他地方（轉(zhuǎn)移性鈣化）。 如果鈣化區(qū)域中組織標(biāo)本是巨大的，可能無(wú)法獲得體面部分而不先脫鈣標(biāo)本。 另一種可能性，是采用“表面脫鈣”的石蠟塊，以便在那里不被預(yù)期的，當(dāng)試樣加工鈣的存在下，獲得的部分。
脫鈣程序比較簡(jiǎn)單，在組織學(xué)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)文本被廣泛地討論。如果高品質(zhì)的結(jié)果不過(guò)是要得到，有些點(diǎn)是值得重視的。
骨的結(jié)構(gòu)
骨骼是由含有1型膠原纖維鈣化基質(zhì)包圍細(xì)胞（骨）的。 在基體中的鈣是在羥基磷灰石結(jié)晶形式的[Ca 10（PO 4）6（OH）2]這是纖維狀元件之間沉積。 這些晶體脫鈣的過(guò)程中，如果正確地執(zhí)行，葉凝聚力組織致密纖維結(jié)締組織的物理特性中被溶解掉了。
有兩種類型的成熟骨的。 皮質(zhì)或密質(zhì)骨形成長(zhǎng)骨和頭骨的扁骨的主要部分的軸和具有基于所謂的骨單位圓柱形結(jié)構(gòu)（圖3）的結(jié)構(gòu)的非常致密的結(jié)構(gòu)。 松質(zhì)骨，骨小梁或骨松質(zhì)有一個(gè)更加細(xì)致的安排，由薄薄的隔板（小梁）連接骨板之間找到了骨髓。 它位于脊椎和長(zhǎng)骨的骨骺（圖4）。 既緊湊和松質(zhì)骨發(fā)育中的層或lamelle，其中膠原纖維在結(jié)構(gòu)上定向，并顯示根據(jù)偏振光顯微鏡的特征的圖像（參見(jiàn)圖5）。
圖3：從長(zhǎng)骨用甲酸（H＆E）*佳脫鈣的橫截面。許多骨單位與外圍水泥線被示出。 以及染骨細(xì)胞的細(xì)胞核都存在，表明脫鈣終點(diǎn)是不*標(biāo)。
圖4：松質(zhì)骨的長(zhǎng)骨（H＆E）的一個(gè)骨骺部分脫鈣（粉紅色）和透明軟骨（藍(lán)色）。 骨的骨小梁細(xì)膩保存完好的是骨髓和脂肪細(xì)胞相關(guān)的精細(xì)結(jié)構(gòu)。 色斑的嗜堿性/嗜酸性平衡良好的維護(hù)指示甲酸脫鈣是*佳的。
圖5：密質(zhì)骨的長(zhǎng)骨（H＆E）的軸上的脫鈣部分。本節(jié)是在偏振光下拍攝以展示同心lamelle形成骨單位。 雙折射是由于膠原纖維在骨基質(zhì)的連續(xù)層之間的不同的方位。
仔細(xì)考慮接收到的用于處理任何骨樣品的性質(zhì)是很重要的，因?yàn)槠べ|(zhì)和骨松質(zhì)的相對(duì)量是很重要的，并會(huì)確定所需的脫鈣和處理的時(shí)間。 例如，髂嵴環(huán)鉆標(biāo)本由皮質(zhì)骨的邊緣覆蓋的松質(zhì)骨的圓柱體。 皮質(zhì)骨將是*后脫鈣過(guò)程中放棄其鈣鹽除非它是完全脫鈣難度將會(huì)經(jīng)歷獲得體面的部分。
骨的固定
為了保護(hù)骨細(xì)胞和纖維元件所造成的作為脫鈣劑的酸的損害，這是特別重要的，以徹底解決這些標(biāo)本之前脫鈣。 脫鈣期間較差固定的標(biāo)本成為浸漬和染色之后不佳。 這是非常明顯的含骨髓領(lǐng)域。 因此，通常的做法是對(duì)實(shí)驗(yàn)室固定時(shí)間為骨骼標(biāo)本脫鈣開(kāi)始前延長(zhǎng) 。 它提供隨時(shí)為固定液穿透骨頭是很重要的，所以皮膚和軟組織應(yīng)該從大樣本，如果可行的去除。 骨標(biāo)本應(yīng)盡快以提高固定和固定劑的適當(dāng)量提供鋸成薄片。 高質(zhì)量的細(xì)齒鋸應(yīng)該用來(lái)制備骨片。 粗鋸可引起相當(dāng)大的機(jī)械損壞，并迫使骨碎片進(jìn)入存在于試樣中的軟組織（參見(jiàn)圖6）。
福爾馬林緩沖液是用于骨令人滿意的固定液但其中一些實(shí)驗(yàn)室將使用替代品，如1的鋅福爾馬林的混合物，B5，甲醛乙醇（Davidson的固定劑），或布安骨髓的保存是很重要的。
圖6：環(huán)鉆標(biāo)本中骨碎片已在籌備（箭頭）被強(qiáng)制進(jìn)入骨髓的空間。 這是沾上馮·科薩的方法來(lái)證明鈣的未脫鈣樹(shù)脂部分。
脫鈣代理 - 概述
主要有三種類型的脫鈣代理：
那些基于強(qiáng)無(wú)機(jī)酸
那些基于弱有機(jī)酸
那些組成的螯合劑 。
為了方便大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室選擇從現(xiàn)有的許多專有試劑。 這些產(chǎn)品的潛在用戶應(yīng)咨詢相關(guān)的MSDS，以確定活性成分存在，如果它沒(méi)有明確提供的技術(shù)資料說(shuō)明。
脫鈣代理 - 強(qiáng)酸
強(qiáng)酸如鹽酸或硝酸的濃度高達(dá)10％是*快速的動(dòng)作，但如果使用過(guò)多的時(shí)間會(huì)迅速引起核染色的損失，并且可以浸軟組織中。 重要的是，適當(dāng)?shù)慕K點(diǎn)試驗(yàn)用于減少標(biāo)本對(duì)這些藥物的暴露。 一般來(lái)說(shuō)專有decalcifiers自稱是迅速行動(dòng)即根據(jù)強(qiáng)酸，*常用的鹽酸，并應(yīng)謹(jǐn)慎使用，注重提供的說(shuō)明書，如果效果不錯(cuò)，來(lái)獲得。 例如Surgipath的Decalcifier II?是迅速的行動(dòng)，并含有鹽酸。 圖7展示了用無(wú)機(jī)酸decalcifier*出適當(dāng)端點(diǎn)延長(zhǎng)治療的后果。
表1列出了一些比較常見(jiàn)的無(wú)機(jī)酸為基礎(chǔ)的decalcifiers的。 histotechnology的標(biāo)準(zhǔn)教科書應(yīng)征詢一個(gè)更全面的列表。
表1：礦物酸decalcifiers
Decalcifier | 公式 | 評(píng)論 |
硝酸 | 5％在蒸餾水中 | 迅速行動(dòng)，*過(guò)終點(diǎn)會(huì)損害染色。 |
Perenyi的流體 （1882） | 10％的硝酸40毫升 0.5％鉻酸30毫升 無(wú)水酒精30毫升 | 傳統(tǒng)decalcifier的decalcifies比硝酸水溶液更慢。 在行動(dòng)相當(dāng)迅速，*過(guò)了終點(diǎn)會(huì)損害染色。 |
鹽酸 | 在蒸餾水中的5-10％的 | 福爾馬林應(yīng)該從標(biāo)本放置在HCl避免雙 - 氯甲基醚（一種致癌物質(zhì)）的形成前要洗凈。 迅速行動(dòng)，*過(guò)終點(diǎn)會(huì)損害染色。 |
馮埃布的解決方案 | 飽和氯化鈉的溶液。 50毫升 蒸餾水42毫升 鹽酸8毫升 | 迅速行動(dòng)，*過(guò)終點(diǎn)會(huì)損害染色。 |
圖7：脫鈣松質(zhì)骨（H＆E）的一個(gè)部分。 對(duì)該樣品進(jìn)行脫鈣用鹽酸decalcifier為過(guò)多的時(shí)間，而無(wú)需使用一個(gè)適當(dāng)?shù)亩它c(diǎn)檢測(cè)。 雖然組織要素是凝聚力的染色非常差，顯示具有較強(qiáng)的，低分化曙紅起來(lái)完全沒(méi)有核染色。
脫鈣代理 - 弱酸
弱酸，例如甲酸很受歡迎，被廣泛用于脫鈣。 甲酸可以用作簡(jiǎn)單的10％水溶液，或與福爾馬林或用緩沖。 雖然它比強(qiáng)酸劑慢它是在動(dòng)作更加溫和，不太可能干擾核染色。 1,7基于甲酸的專有decalcifier的一個(gè)例子是Surgipath的Decalcifier予?。 它還含有甲醛，并聲稱修復(fù)以及脫鈣和溫柔的動(dòng)作。 其它酸如三*********（TCA）也被使用。 *********，如一些固定劑的一個(gè)組分具有弱脫鈣特性。
表2：弱酸decalcifiers
Decalcifier | 公式 | 評(píng)論 |
甲酸 | 在蒸餾水中的10％的 | 一個(gè)簡(jiǎn)單有效的decalcifier。 |
埃文斯和Krajian | 甲酸25毫升 檸檬酸納10g 蒸餾水75毫升 | 一個(gè)有效的甲酸decalcifier緩沖檸檬酸。 |
克里斯騰森 | 甲酸18毫升 甲酸鈉3.5克 蒸餾水82毫升 | 一個(gè)有效的甲酸decalcifier緩沖甲酸 |
古丁和斯圖爾特 | 甲酸5 - 25毫升 40％的甲醛5毫升 蒸餾水75毫升 | 甲酸decalcifier添加了福爾馬林，聲稱固定和脫鈣。 |
脫鈣劑 - 螯合劑
通過(guò)從磷灰石晶體的表面捕獲的鈣離子，慢慢地減少其大小，螯合劑如乙二胺四乙酸（EDTA），工作。因?yàn)檫@個(gè)過(guò)程是十分緩慢的，但很溫和（周可能取決于樣品的大小被要求），該試劑不適合于緊急標(biāo)本，但更適合于研究應(yīng)用中的質(zhì)量非常高的形態(tài)是必需的或特定分子的元素必須是保存諸如IHC，FISH或PCR技術(shù)。 這是用在大約14％的濃度作為中和的溶液。在其中將EDTA脫鈣率是pH依賴性的。 它通常用于在pH值7.0。 它可以更迅速地在pH為10，但有些組織元素可以在堿性pH下被損壞。
表3：螯合劑
Decalcifier | 公式 | 評(píng)論 |
中性EDTA | 乙二胺四乙酸二鈉鹽250克 蒸餾水1750毫升 加入氫氧化鈉使pH值至7.0（約25克將需要）。 | 徒緩慢而引起組織損傷小。 傳統(tǒng)的污漬基本上不受影響。 |
影響脫鈣率的因素
濃度。
活性劑的濃度將影響在其中鈣被去除的速率。 發(fā)表制劑脫鈣溶液在速度和組織損傷的程度之間的平衡。它必須記住，活性劑的濃度將被耗盡，因?yàn)樗Y(jié)合了鈣，所以它是明智的，使用大容量decalcifier和在脫鈣過(guò)程中更新了好幾遍。
溫度。
溫度升高會(huì)加快脫鈣率反而會(huì)增加組織損傷率等都必須非常謹(jǐn)慎地使用。
激越。
輕輕搖動(dòng)可能增加的速度咯。
流體的訪問(wèn)。
與固定新鮮decalcifier應(yīng)可隨時(shí)到試樣的所有表面。 這將增強(qiáng)擴(kuò)散和滲透到標(biāo)本，并促進(jìn)解決方案，電離和去除鈣。
其它技術(shù)用于增加脫鈣的效率
用EDTA使用*聲已被成功地用于加快環(huán)鉆標(biāo)本脫鈣用于后續(xù)的分子分析。 在這個(gè)過(guò)程中的溫度必須小心地控制。 微波治療已被用于與鹽酸decalcifiers但升高的溫度可能會(huì)損壞形態(tài)和染色造成假象。離子交換樹(shù)脂已被納入一些脫鈣協(xié)議。 它們被加入到容器保持decalcifier和占用的離子鈣維持酸的有效性。 如果酸decalcifiers中使用適當(dāng)?shù)臄?shù)量及定期更換使用這些樹(shù)脂的可能是不必要的。電解脫鈣，其中骨被放置在酸decalcifier并連接到通過(guò)其電流施加用電極是一個(gè)還沒(méi)有得到廣泛的技術(shù)接受，因?yàn)樵斐蔁釗p傷試樣的潛力。
確定終點(diǎn)脫鈣
如果高品質(zhì)的結(jié)果是要得到以確定在其中所有的鈣已經(jīng)被去除的點(diǎn)是很重要的，因?yàn)?，從此時(shí)起，組織損傷似乎發(fā)生的速度越來(lái)越快。 過(guò)度脫鈣，特別是與強(qiáng)酸decalcifiers，敗壞嗜堿性元素如細(xì)胞核的染色和在某些情況下可導(dǎo)致較軟的組織元素的浸漬。 在另一方面標(biāo)本是不完全脫鈣可能很難或不可能一節(jié)。
*好的方法，特別是具有大的標(biāo)本如股骨頭，是對(duì)X-射線的試樣。 一個(gè)好的品質(zhì)的X射線會(huì)清楚地揭示微小殘余的鈣沉積，并允許進(jìn)一步的治療，如果必要的。 它是用于以下的大型試樣如股骨頭脫鈣的過(guò)程（參見(jiàn)圖8）的極好方法。 一個(gè)簡(jiǎn)單的化學(xué)測(cè)試時(shí)可以有些酸decalcifiers被使用（尤其是甲酸）被應(yīng)用。 草酸銨溶液加入到脫鈣的*終變化，已用氫氧化銨中的樣品。 1如果鈣存在草酸鈣沉淀會(huì)形成表明脫鈣可能是不完整的，并在脫鈣較長(zhǎng)的時(shí)間是必需的。 當(dāng)然這個(gè)測(cè)試是*好在比較近decalcifier的變化（暴露于組織為比如，僅一小時(shí)）。 物理測(cè)試需要操縱，彎曲進(jìn)行探測(cè)或修整試樣的“感覺(jué)”剩余鈣化區(qū)域。 雖然這種方法可能是成功經(jīng)驗(yàn)的手中它通常被認(rèn)為是不可靠的。 機(jī)械損傷可發(fā)生彎曲或探測(cè)和鈣的小額存款很容易被錯(cuò)過(guò)時(shí)。 7通過(guò)仔細(xì)權(quán)衡標(biāo)本漂洗和印跡也被描述后，確定端點(diǎn)的方法。 這可能是一種有效的方法對(duì)大樣本。（本文來(lái)源：徠卡顯微鏡怎么脫鈣？）
如果您認(rèn)為脫鈣終點(diǎn)靠近，你想慢下來(lái)的過(guò)程，以避免過(guò)度脫鈣和隨之而來(lái)的組織損傷，如可能出現(xiàn)這種情況時(shí)，您的實(shí)驗(yàn)室在周末是沒(méi)人住，標(biāo)本可以從decalcifier被刪除，漂洗并放回福爾馬林（如果正在使用鹽酸重要）。 脫鈣可以被恢復(fù)時(shí)，方便。另一種方法是冷藏的樣品在其decalcifier放慢進(jìn)程4?C。 1
圖8：一種X射線系列繼股骨頭脫鈣與甲酸/檸檬酸decalcifier的過(guò)程。 X線片均采用惠普Faxitron生產(chǎn)?和允許精確地遵循過(guò)程和終點(diǎn)，以得到正確的識(shí)別。
圖9：腓骨的脫鈣石蠟切片（H＆E）。 注試件的尺寸。 使用化學(xué)端點(diǎn)測(cè)試再加工使用擴(kuò)展的時(shí)間表石蠟有人脫鈣與甲酸劑。 13 Y /，男性持續(xù)他的右腓骨的病理性骨折跌倒后。 X線片顯示為（R）腓骨中間軸的骨性膨大。 病理診斷為骨囊腫病理性骨折。 本節(jié)準(zhǔn)備在病理學(xué)武力學(xué)院（美國(guó)）在1983年的骨實(shí)驗(yàn)室。
治療下列脫鈣和前處理
各種方法用于中和殘余酸decalcifier處理之前已經(jīng)公布，包括在自來(lái)水充分洗滌或堿性溶液中的應(yīng)用。 通常很短，有效洗滌自來(lái)水中，應(yīng)足以為任何剩余的酸處理過(guò)程中會(huì)被去除。它以除去大部分的decalcifier的，以避免污染的處理劑和用酸的處理器是非常重要的。
選擇一個(gè)合適的時(shí)間表脫鈣骨或其他組織脫鈣
一旦礦物已被刪除的標(biāo)準(zhǔn)處理進(jìn)度表可以被使用。 它必須牢記的是，盡管完全脫鈣，骨，尤其是密質(zhì)骨，將包含需要徹底的處理密集的地區(qū)。 這是更好地使用時(shí)間表，太長(zhǎng)不是太短。 您的選擇將取決于樣品的性質(zhì)和大小。 真空中滲蠟的應(yīng)用程序應(yīng)該提高成品塊的質(zhì)量。
表面脫鈣
這是與鈣的小意外存款可在石蠟塊中遇到的處理（參見(jiàn)圖10）的方法。 一般而言，這是修剪塊切片揭露了鈣被發(fā)現(xiàn)的標(biāo)本后。 重要的是在這一階段，以盡量避免廣泛地破壞塊的表面上。 后的組織已經(jīng)暴露塊可以從切片除去并面朝下放置在酸decalcifier為15 - 60分鐘。 這種表面處理將使decalcifier穿透小的距離成塊，并溶解鈣。 該塊可以再在清水中徹底沖洗，以除去殘留的酸，冷凍和切片。 塊的仔細(xì)調(diào)整將被要求，因?yàn)閐ecalcifier會(huì)滲透非常小的距離成塊，允許采取只有幾部分組成。
圖10：從在意料之外的鈣沉積遇到肉芽腫標(biāo)本（藍(lán)色）A節(jié)。 如果表面脫鈣已應(yīng)用于該塊質(zhì)量較好的部分本來(lái)準(zhǔn)備。
結(jié)論
脫鈣是一個(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程，但要取得成功，需要：
標(biāo)本仔細(xì)初步評(píng)估
徹底固定
合理的厚度為固定和處理芯片的制備
合適的decalcifier有足夠量的選擇，定期更換
仔細(xì)確定端點(diǎn)
使用合適的時(shí)間表徹底的處理。