奧林巴斯顯微鏡激光系統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡

 通常用于光學(xué)顯微鏡的激光器是高強(qiáng)度的單色光源，這是因?yàn)閷?duì)各種技術(shù)，包括光學(xué)捕獲，壽命成像研究中，光漂白恢復(fù)和全內(nèi)反射熒光的工具是有用的。 此外，激光也是最常用的光源掃描共聚焦熒光顯微鏡，并已動(dòng)用，雖然不經(jīng)常，在傳統(tǒng)的寬場熒光調(diào)查。

激光器發(fā)出單色光的激烈包是一致和高度準(zhǔn)直，以形成緊密的光束擴(kuò)展率非常低。 相對(duì)于其他的光源，由激光器發(fā)射的極純的波長范圍內(nèi)具有由鎢鹵或弧光放電燈無雙的帶寬和相位關(guān)系。 其結(jié)果是，激光束可行駛長距離和可擴(kuò)展以填充孔或聚焦到與亮度的一個(gè)高層次的一個(gè)非常小的點(diǎn)。 除了共同所有的激光器，其中包括一個(gè)增益介質(zhì)（光源），激發(fā)源（電源），以及諧振器的相似性，這些光源的大小從根本上有所不同，成本，輸出功率大，光束質(zhì)量好，功耗和運(yùn)行壽命。

大多數(shù)激光系統(tǒng)產(chǎn)生的單色光的相干介紹了這些光源古典廣角鏡的應(yīng)用問題。 通過干擾在每個(gè)表面在光路中的光散射和衍射圖譜進(jìn)行了介紹。 此外，本領(lǐng)域和孔徑光闌，以及污垢，也產(chǎn)生偽影。 這些不良影響可以被最小化或通過各種技術(shù)消除。 最常用的方法包括通過在時(shí)間上快速變化的光源和顯微鏡之間的光路長度，或在掃描試樣逐點(diǎn)因?yàn)槭窃?a title='共聚焦顯微鏡' target='_blank' class='seolabel'>共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的情況下的加擾的激光。 此外，干擾和其他構(gòu)件常?？梢酝ㄟ^光圈掃描技術(shù)消除。 如果激光束的光路長度或相干性狀態(tài)波動(dòng)以更快的間隔比檢測器的積分時(shí)間（實(shí)際上是視頻幀速率），散斑和散射偽像從圖像中消失。

一個(gè)成功的技術(shù)，通過一些調(diào)查來改進(jìn)微分干涉對(duì)比（DIC）與氬離子激光光源產(chǎn)生的圖像是定位一個(gè)圓形玻璃楔形，紡紗每分鐘2500圈，在光路。 在光路長度的快速變化是由在楔厚度的差異引入楔形旋轉(zhuǎn)擴(kuò)展的激光光束的前方。 目前，路徑長度的變化通常是通過采用光纖光導(dǎo)管，以便將光源和顯微鏡之間的光來實(shí)現(xiàn)。 振動(dòng)的纖維生產(chǎn)中的光路長度連續(xù)變化，使光束成為在時(shí)間上不連貫在低于該水平振動(dòng)的頻率。 的振動(dòng)可以由壓電裝置，揚(yáng)聲器，或在激光頭中使用的冷卻風(fēng)扇產(chǎn)生。

如圖1所示，是一種自鎖模鈦：藍(lán)寶石激光脈沖，這是目前在大多數(shù)多光子熒光顯微鏡調(diào)查的優(yōu)選激光激發(fā)源之一。 鈦藍(lán)寶石鎖模激光器提供一個(gè)大的波長的調(diào)諧范圍，從大約690至超過1050納米，與脈沖寬度，長度約100飛秒。 此外，這些激光器具有足夠的功率（大于100毫瓦在整個(gè)調(diào)諧范圍）的雙光子激發(fā)的熒光團(tuán)最飽和。 以確保適當(dāng)?shù)睦鋮s和激光晶體的濕度控制，將氮?dú)獗萌朊芊獾募す忸^，這是由一個(gè)外部冷卻器保持在恒定的溫度。

許多激光系統(tǒng)所產(chǎn)生的光被線性偏振，與垂直取向的偏振矢量。 這個(gè)屬性可以被利用于需要偏光照明光源，如微分干涉相襯，偏光測量，或熒光偏振各向異性定量調(diào)查申請(qǐng)。

激光束的相干性和偏振特性是由光的光束的橫截面，或簡檔，其利用從所述激光的出射反射鏡的距離的增加改變了分布測定。 的激光束的特性下面的討論是作為可能證明在采用激光顯微鏡中成像，激光俘獲和其他應(yīng)用有用的受試者的一般概述。

當(dāng)激光器工作在最簡單的橫向電磁模式中 ，被稱為TEM（00）模式下，所發(fā)射的光束具有平面波陣面和高斯強(qiáng)度（輻照度）的配置文件。 激光束直徑通常被定義為在該強(qiáng)度已經(jīng)下降到E（E-2）（13.5％），其峰值價(jià)值。 激光束的高斯分布的產(chǎn)生是由于衍射，從而防止一個(gè)完全準(zhǔn)直光束的傳播和誘導(dǎo)橫向傳播的光波的。 附近的激光輸出孔（稱為近場 ）中，光束的相位方面可以變得紊亂。 作為結(jié)果，該波束的橫截面形狀，尺寸和輻照剖面，然后迅速用從激光距離發(fā)生變化。 在更遠(yuǎn)的距離（ 遠(yuǎn)場 ），相位戰(zhàn)線穩(wěn)定到所得的高斯分布。 在一些參考文獻(xiàn)中，在近場和遠(yuǎn)場被稱為由菲涅耳區(qū)和夫瑯禾費(fèi)區(qū)域的替代術(shù)語分別。 近場有時(shí)也被稱為瑞利范圍。 遠(yuǎn)場開始的距離，Z，由定義

其中，A（0）是光束直徑在出射孔徑，λ是光由激光器發(fā)射的光的波長。 應(yīng)用此公式來氬激光發(fā)射一個(gè)0.6毫米的腰部直徑的光束在488納米的波長，遠(yuǎn)場開始于從所述出口孔約74厘米。

示于圖2是激光束的幾何形狀和發(fā)散的近場和遠(yuǎn)場的示意圖。 如上面所討論的，光束可以被認(rèn)為基本上是波陣面的平行束即經(jīng)歷在近場小擴(kuò)散。 超出近場，光束發(fā)散角（θ），這是從光束的中心測量到的邊緣（E（E-2）），變大并成為關(guān)鍵的參數(shù)中，根據(jù)確定的光束直徑（D）的公式：

其中D是可變表意激光束的直徑，L表示從激光出口孔徑的光束上的測量點(diǎn)之間的距離的長度。 在實(shí)踐中，一些激光束特性，包括輻照剖面，在許多顯微鏡應(yīng)用的關(guān)鍵因素，并在遠(yuǎn)場的距離的知識(shí)，可能需要在配置的攝像系統(tǒng)。 表1給出了計(jì)算出的該距離的值（使用上面給出的方程）為一些普遍使用的激光和發(fā)射線，和典型的束腰直徑。

與否的光束呈現(xiàn)高斯字符是在大多數(shù)激光應(yīng)用中很重要，因?yàn)楣馐ǔ１仨毤?，形狀和其他由透鏡和其他光學(xué)元件修改。 高斯光束具有一定的自定義轉(zhuǎn)換特性，而這些假設(shè)能夠?qū)?duì)于該光束將如何傳播通過光學(xué)系統(tǒng)。

角半徑（或光束發(fā)散角，見圖2）中，θ（弧度）指定，高斯光束在遠(yuǎn)場的近似的表達(dá)式：

其中，a（0）是光束束腰半徑在激光出口孔徑。 束腰直徑是激光波長，諧振腔長度，并且所述腔的其它設(shè)計(jì)參數(shù)的函數(shù)。 如從激光的距離增加，（z）的光束束腰半徑由下式給出：

通常，激光束的特征是光束傳播參數(shù)，如M的平方，或K（相當(dāng)于M的平方的倒數(shù)），從近場和遠(yuǎn)場測量的組合來確定，如下所示：

M ^2，這被稱為傳播常數(shù)或傳播因子的較 小的值，均顯示出較高的光束質(zhì)量，特別是在參照的較小直徑和發(fā)散。 該因子描述了實(shí)際光束的該理想高斯光束的關(guān)系。

相干高斯光束有導(dǎo)致他們從非相干光束通過透鏡和反射鏡，會(huì)有不同的傳輸變換的特定屬性。 在一個(gè)衍射極限的光束的情況下，一個(gè)高斯光束的強(qiáng)度分布是高斯分布本身，只要該光束不通過透鏡孔徑截?cái)唷?/span> 當(dāng)高斯光束的直徑是透鏡的二分之一的開口直徑時(shí)，射出光的強(qiáng)度分布保持高斯。 當(dāng)高斯光束直徑等于鏡頭的光圈的直徑，輸出光束的強(qiáng)度分布是高斯函數(shù)的和的混合物中，一個(gè)艾里斑。 最后，高斯光束直徑比透鏡孔的直徑較大的顯著產(chǎn)生的艾里斑的輸出配置文件。 在后一種情況下，大部分的激光功率可以由于透鏡入射孔徑滿溢丟失。

高斯光束光學(xué)系統(tǒng)的整體主題的全部內(nèi)容在許多教科書中，并在此不再贅述細(xì)節(jié)可以從更全面的來源。 兩種類型的操縱高斯光束是特別感興趣的，利用激光顯微鏡技術(shù)的- 束濃度和擴(kuò)束 。

當(dāng)激光束是由一個(gè)無像差顯微鏡物鏡（光束濃度）聚焦成一個(gè)非常小的光點(diǎn)，光點(diǎn)的焦點(diǎn)處（在距離 z）的半徑由下式給出的表達(dá)式：

其中 f是透鏡的焦距。 作為一個(gè)例子，如果使用具有1.3的數(shù)值孔徑（產(chǎn)生約1.6毫米的焦距）一個(gè)100x物鏡集中具有0.3毫米的半徑，聚焦光點(diǎn)半徑（測定的氬激光器的488納米的光束從前面的方程）為0.8微米。 通過擴(kuò)束五倍增加光束束腰（如下面討論的）將導(dǎo)致約0.16微米的聚焦光斑半徑。

要注意的是極高的功率密度在濃縮的激光束的焦點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)很重要。 一個(gè)10毫瓦的光束聚焦到衍射極限的光點(diǎn)0.22微米直徑的結(jié)果在每平方厘米約30百萬瓦特的功率密度。 這樣高的能量水平可迅速降解或破壞透鏡和濾光器的涂層，以及引入到生物標(biāo)本相當(dāng)大的光化學(xué)損傷。 然而，對(duì)于這樣一個(gè)微小光點(diǎn)的大小，熱能的擴(kuò)散可以是非常有效的水，一個(gè)高能量，近紅外線光束可以做小損傷的生物試樣，除非由試樣吸收的能量是足夠高的。

激光器在光學(xué)顯微鏡的許多應(yīng)用中，激光束首先通過使用開普勒或伽利略擴(kuò)束器，其中任何一個(gè)實(shí)際上是顛倒望遠(yuǎn)鏡（典型的激光光束擴(kuò)展解剖特征示于圖3）的展開。 一個(gè)相干高斯光束的發(fā)散度可以減小，并且光束最佳準(zhǔn)直在較長的距離，如果激光束被第一膨脹。 參照前面的方程組，該光束的角半徑，指定θ，是成反比的光束束腰半徑，A（0），在激光出射孔徑。 因此，擴(kuò)大束腰半徑按比例減小的分歧。

它是實(shí)用的許多應(yīng)用中顯微鏡管激光輸出直接進(jìn)入顯微鏡的光路通過柔性的光纖（如圖4）。 這種技術(shù)是最好的嚴(yán)格對(duì)準(zhǔn)激光和顯微鏡，這就需要采用一個(gè)巨大的，無振動(dòng)的光學(xué)平臺(tái)和眾多的固定反射鏡等組成的替代方法。

當(dāng)激光束通過透鏡聚焦到光纖，耦合效率，并且出現(xiàn)從纖維束的特性在很大程度上取決于纖維幾何形狀。 大多數(shù)用于激光輸送光學(xué)纖維都與一個(gè)石英芯構(gòu)成。 這些纖維包括制造具有高折射率的二氧化硅和由套筒環(huán)繞的內(nèi)芯的，稱為包層 ，低折射率材料構(gòu)成。 防止光從沿其長度由在纖芯和包層的界面的全內(nèi)反射逸出的纖維。 包層可以由二氧化硅，玻璃，硬質(zhì)的氟聚合物，或柔軟的硅樹脂制成。

光纖按照其內(nèi)芯的直徑分為單模或多模 。 一種單模光纖允許的只有最低階模式的傳播在一個(gè)特定的波長（圖4）。 波長傳播和偏振保存的波是由纖維直徑來確定。 雖然其他波長可以傳播，他們這樣做降低效率。 典型的單模光纖直徑范圍從3到6微米為可見光波長的光，并且單模光纖的輸出光強(qiáng)分布是高斯型的。

一種多模光纖允許多于一個(gè)模的傳播，并且不局限于單一波長。 多模光纖的內(nèi)芯比單模光纖，范圍從約100微米至1.2毫米的直徑。 從多模光纖的輸出輻照剖面的扁平形狀，稱為頂帽輪廓 ，帶是由核心確定和包層的折射率的數(shù)值孔徑。

驗(yàn)收錐角纖芯，θ，是關(guān)系到數(shù)值孔徑光纖的NA，如下所示：

其中，n表示折射率。 光纖纖芯的數(shù)值孔徑，而光束濃度透鏡的匹配時(shí)發(fā)生的激光到光纖芯的高效耦合。 光傳輸通過光纖的效率通常高達(dá)約90％，但也可以大幅降低（僅60％或70％）的由具有非常小的半徑（小于3厘米）的彎曲。

在利用任何激光，至關(guān)重要的是，不僅防止任何直接或鏡面反射激光光線入射到觀察者的眼中，但是也避免了光束的反射從光學(xué)系統(tǒng)的一個(gè)組成部分回到激光器系統(tǒng)。 前者是一個(gè)明顯的人身安全預(yù)防措施，而后者則謹(jǐn)慎重要的是要避免一個(gè)額外的反射器從返回一個(gè)相干光束返回到激光，從而導(dǎo)致可能對(duì)系統(tǒng)的損害。

激光光源的穩(wěn)定性是在許多應(yīng)用中的一個(gè)重要方面，尤其是在定量顯微術(shù)，其中光照強(qiáng)度的波動(dòng)可以實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不利影響。 一些相關(guān)的受激輻射和腔長的波動(dòng)因素可以誘發(fā)的輸出光束頻率的噪音，但造成的波動(dòng)幅度等擾動(dòng)可以建立在光輸出功率均為高頻強(qiáng)度噪聲和緩慢變化（漂移）。 這些強(qiáng)度波動(dòng)的一些來源都涉及到激光頭本身或電源的功能。 在輸出光束的各種激光器類噪聲的最常見的來源如下：

• 氣體激光器 -從諧振器的振動(dòng)，從光泵浦源，等離子體振蕩和離子放電過程中的不穩(wěn)定噪聲，在電源電流的波動(dòng)，從冷卻水的湍流顫，而在強(qiáng)制空氣冷卻系統(tǒng)風(fēng)扇引起的噪音鏡象偏差都潛在的噪聲源。

• 固態(tài)激光器 -噪聲源包括顫，為燈和二極管泵浦源，腔對(duì)準(zhǔn)誤差和隨機(jī)頻率相關(guān)的噪聲泵浦源的波動(dòng)（稱為1 / f噪聲），是關(guān)系到激光介質(zhì)的熱波動(dòng)。

• 染料激光器 -兩個(gè)噪聲（高頻）和密度的不均勻性和氣泡在染料溶液中漂移的結(jié)果，和由染料和泵激光泵源的不穩(wěn)定性。

• 半導(dǎo)體（二極管）激光器 -噪音可導(dǎo)致從驅(qū)動(dòng)器中（偏差）的電流或溫度，和1 / f噪聲是因在結(jié)載波的捕獲和由其他類型的載流子（電子-空穴）復(fù)合效果的波動(dòng)。

所有的激光是比較容易受到他們的電源引入的噪聲。 開關(guān)電源，這已成為因?yàn)樗麄兊男屎托〕叽缙毡椋貏e容易引入紋波激光系統(tǒng)的頻率范圍到幾十千赫。 這樣的干擾，當(dāng)它影響光束在光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)，可能是特別麻煩的診斷與排除。 主要的困難是由于具有相似的噪聲由其它來源，如在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中電磁場引入到系統(tǒng)中。 為了實(shí)現(xiàn)足夠的輸出穩(wěn)定性，半導(dǎo)體激光器必須具有二極管的電流供應(yīng)的最高電穩(wěn)定性和噪聲最低可用的，并且具有精確的溫度控制下操作。 其他外部噪聲源必須加以控制，包括粉塵在實(shí)驗(yàn)室和振動(dòng)當(dāng)?shù)亟煌ê徒ㄖO(shè)備發(fā)起。

連續(xù)波（CW）激光束強(qiáng)度可以通過電子控制的管電流或通過利用該調(diào)制光強(qiáng)度的外部元件的穩(wěn)定化。 兩種不同的方法被經(jīng)常采用，以控制管的驅(qū)動(dòng)電流。 在恒定電流方式中，管電流直接通過電子反饋回路，以減少波動(dòng)的控制。 因?yàn)榧す廨敵鲆搽S溫度變化，如果提供足夠的溫度控制這種類型的控制電路是最有效的。 恒定輸出功率穩(wěn)定系統(tǒng)，通過控制驅(qū)動(dòng)電流以響應(yīng)于來自該輸出光束通過該樣品的電路產(chǎn)生的信號(hào)操作一個(gè)分束器和光電二極管顯示器。 該物理安排適用于氣體激光器和其他一些幾何形狀，但更小的半導(dǎo)體激光器通常被裝配在已經(jīng)包括一個(gè)不可分割的光電二極管的封裝。 從激光晶片的后方端面的監(jiān)視器光電二極管的樣品發(fā)射，并產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)，使輸出功率的反饋控制。

用于提供激光強(qiáng)度穩(wěn)定的外部元件通常采用的快速反饋系統(tǒng)來控制的電 - 光調(diào)制器，最大限度地減少在光束功率的波動(dòng)。 外部普克爾盒調(diào)制器（見圖5）是可從許多制造商，并且可以使用，原則上，以穩(wěn)定的任何連續(xù)波激光的輸出功率。 大強(qiáng)度的波動(dòng)（最多約50％）可以通過該技術(shù)得到糾正，但有一個(gè)比例減少，總的輸出功率。 廣泛的糾錯(cuò)能力是有許多系統(tǒng)非常重要。 氦 - 鎘激光器，例如，可以表現(xiàn)出變異的20％左右的輸出功率，部分原因是由于某些束頻率之間的強(qiáng)等離子體振蕩。 系統(tǒng)存在所報(bào)告的是適合于它們的輸出功率的百分之幾百分之調(diào)節(jié)CW和鎖模激光器來，并在一個(gè)頻率范圍從直流到幾百兆赫，具有500:1噪聲衰減或更大。

一普克爾盒調(diào)制器的基本組件示于圖5。 用于調(diào)節(jié)激光的輸出強(qiáng)度，類似于在圖5所示的設(shè)計(jì)的外部設(shè)備，有時(shí)被歸類或下一詞噪聲食銷售。 后面利用Pockels效應(yīng)電光調(diào)制器的基本概念是基于一種機(jī)制，以極快的速度，以提供一種可變光束衰減器，用于激光強(qiáng)度的變化控制單元的偏振特性。 激光輸出的偏振狀態(tài)決定了調(diào)制器的總衰減，但高達(dá)80％的傳輸是可能的。 以下，從激光頭發(fā)射的光束的一部分由分束器轉(zhuǎn)移到一個(gè)光電二極管，它的強(qiáng)度進(jìn)行比較，以預(yù)先設(shè)定的（可選擇）基準(zhǔn)強(qiáng)度，并放大該差信號(hào)，以便它可以驅(qū)動(dòng)電光普克爾盒調(diào)制器。 放大后的信號(hào)產(chǎn)生的折射率變化在旋轉(zhuǎn)偏振平面的細(xì)胞，從而正比于所施加的電壓差改變所述光束的衰減。 中表現(xiàn)出的變化的電場（普克耳斯效應(yīng)）的偏振特性變化的物質(zhì)是磷酸二氫鉀和鈮酸鋰，以及這些材料的晶體在光束調(diào)制器通常被利用。

在其中隨機(jī)偏振的光，由普克爾盒系統(tǒng)穩(wěn)定的情況下，調(diào)制器必須定位，交叉的偏振器之間，以及進(jìn)一步的考慮是必要的，以減少這些附加部件上的光束的穩(wěn)定性的影響。 因?yàn)榛覊m，振動(dòng)和其它干擾，可以在光路中的任何一點(diǎn)改變光束的穩(wěn)定性，重要的是外部的穩(wěn)定劑被置于盡可能接近，以在光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)的樣品位置。 這種努力將確保最穩(wěn)定的光束被輸送到樣品。

無論是氬離子激光和氪離子激光器產(chǎn)生的稀有氣體的轉(zhuǎn)換差別很大的功率水平，并且只有少數(shù)的線適合于顯微鏡應(yīng)用多個(gè)發(fā)射線。 風(fēng)冷氬離子激光器被廣泛地用作，因?yàn)樗牧炼燃?jí)，尺寸小，優(yōu)良的光束的幾何形狀，以及對(duì)于它的熒光譜線的適用性和（效率降低），若丹明激發(fā)光源，用于激光共聚焦顯微鏡。 在寬視場或共聚焦熒光顯微鏡利用最氬離子激光器發(fā)出只有兩個(gè)可用的線路，488和514.5納米，相當(dāng)于約75％的總激光功率。 高功率（大于5瓦）氬離子激光器配備專用反射鏡可以在334發(fā)出紫外光線，351，和364納米，并且在從458到529納米的延伸可見波長的其他行。

氪離子激光器已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在顯微鏡比氬激光器由于其稍微長波長輸出較少的應(yīng)用程序。 此外，氪在同一管使用時(shí)只產(chǎn)生10％到30％之多功率為氬氣，而且經(jīng)常需要水冷卻以產(chǎn)生等效的功率輸出空冷氬的系統(tǒng)。 風(fēng)冷離子激光器的一個(gè)主要缺點(diǎn)是缺乏效率的，這會(huì)導(dǎo)致大的功率要求，并產(chǎn)生過多熱量，必須從系統(tǒng)中排風(fēng)扇被除去的強(qiáng)制空氣。 離子激光器的壽命降低，由于氣體的消耗，以截留氣體被埋沒在放電管的壁內(nèi)，根據(jù)需要為激光操作的高電流密度的結(jié)果。

使用氬 - 氪混合物風(fēng)冷激光器已經(jīng)成為在共聚焦顯微鏡流行時(shí)所需要的雙重或多重?zé)晒庋芯繋讉€(gè)照明波長。這種混合氣體激光器是唯一能生產(chǎn)穩(wěn)定的輸出上都波長光譜以及分離的主要線路。 通常用于共焦顯微鏡三個(gè)激光線，488納米和568納米線具有大致相等的功率（10?15毫瓦），而647納米線具有大約50％以上（15?25毫瓦）。 所有離子激光器表現(xiàn)出優(yōu)異的光束質(zhì)量，并且可以從在單線，多線，并且可調(diào)諧的配置不同的制造商處購買。

在632納米的共同氦氖激光（稱為氦氖線 ）的排放已補(bǔ)充的具有綠色排放量（543納米），黃色（594納米），橙色（612納米），紅的變體發(fā)展（633納米），和近紅外（1523納米）的光譜范圍。 盡管大多數(shù)這些激光器是單線發(fā)射器和相對(duì)較低的功率（小于10毫瓦），氦 - 鎘激光器是一個(gè)例外，以大于50毫瓦的功率發(fā)射在325或442納米。

氦-鎘激光器（在圖6中示出）被認(rèn)為是氦-氖家族的成員，并代表了一種經(jīng)濟(jì)來源為連續(xù)波輸出中的紫外線（325納米，在75毫瓦和353在20毫瓦）和紫（442納米，在200毫瓦）的光譜區(qū)。這些激光器依靠鎘蒸氣作為激光介質(zhì)，它是由被加熱的鎘貯存器（攝氏約250度）由氣相電泳均勻地分布在整個(gè)孔中。氦泵保持恒定的氦氣的壓力，這是比鎘蒸氣的高約一千倍。氦鎘激光顯示更多的束噪聲的金屬鎘蒸氣濃度在孔局部的波動(dòng)，主要是因?yàn)樗麄儽群つ释?。他們也有一個(gè)生命周期較短，一般約5000運(yùn)行小時(shí)數(shù)。（本文來源：奧林巴斯顯微鏡激光系統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡）

一組研究人員已描述了使用一個(gè)比成像的共焦顯微鏡耦合到氬激光器在488納米的操作和氦-鎘激光發(fā)射在442納米。該系統(tǒng)使本集團(tuán)能夠從pH敏感的染料測量的強(qiáng)度比BCECF [具有IUPAC的2名'，7'-二（2 -羧乙基）-5 - （和-6 - ） -羧基]在孤立腎小管。類似的測量已利用在兩個(gè)寬視場和共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的氬激光器的458納米線。用氦-鎘激光器的325納米的輸出來同時(shí)激發(fā)兩種染料，并執(zhí)行發(fā)射率成像另一份研究報(bào)告。

氦氖激光器是最廣泛使用的激光系統(tǒng)的范圍廣泛的生物醫(yī)學(xué)和工業(yè)應(yīng)用，并顯示任何激光的最優(yōu)越的高斯光束質(zhì)量。 這些激光器都是現(xiàn)成的成本相對(duì)較低，具有緊湊的尺寸大小，且具有工作壽命長（通常達(dá)40,000至50,000小時(shí)）。 低功耗的要求，卓越的光束質(zhì)量（幾乎純高斯分布），和簡單的散熱要求（對(duì)流）使氦氖激光器的選擇系統(tǒng)的許多共聚焦顯微鏡。

示于圖7是一個(gè)典型的氦氖激光器系統(tǒng)，它具有大的氧化鋁冷陰極作為電子發(fā)射體由玻璃構(gòu)成的剖切圖。 工作在異常輝光電流密度氣體放電區(qū)域，氦氖激光器一般是高電壓，低電流系統(tǒng)，與放電電流被限制在幾毫安和潛力，從幾百到幾千伏。 在陰極上，這最終導(dǎo)致了鋁濺射氧化物涂層的進(jìn)行性惡化，是在氦氖激光器的工作壽命的限制因素。 大口徑排氣管通常有更長的壽命小于管（40,000小時(shí)相對(duì)于約10000小時(shí)，分別）。

氮激光器已經(jīng)在使用了數(shù)年作為脈沖光源為光譜儀和顯微鏡。 輸出被限制在一個(gè)單一的線，有一個(gè)337.1納米的波長，脈沖持續(xù)時(shí)間，從皮秒到納秒。 脈沖重復(fù)率可高達(dá)200個(gè)脈沖每秒。 氮激光器也可以采用泵的染料分子對(duì)波長較長的輻射。 此外，這些激光器已被用于作為光源使用紫外線興奮染料Fura-2的高速鈣比成像。 在此應(yīng)用中，兩個(gè)激光器被使用; 1作為337納米的光的直接來源，而另一個(gè)是染料泵浦以產(chǎn)生380納米的輻射。 每個(gè)脈沖激光在重復(fù)率15每秒，在同步的視頻速率，產(chǎn)生一個(gè)比形象，每66毫秒。

二極管激光器 ，已經(jīng)開發(fā)了幾十年的半導(dǎo)體器件，現(xiàn)已有足夠的輸出功率有興趣的顯微鏡。 最常見的這些裝置的運(yùn)行在近紅外的，但半導(dǎo)體激光器中的紅色和藍(lán)色的區(qū)域（和最近，其他波長的光）下工作，有大量的輸出功率，已經(jīng)開發(fā)出來。 此外，這些二極管激光器現(xiàn)已顯示出改進(jìn)的波束形狀和穩(wěn)定性，使他們能夠取代氦氖激光器在許多應(yīng)用中。 二極管激光器通常有一個(gè)壽命10,000至50,000小時(shí)之間不等，但對(duì)靜電沖擊極其敏感，因此必須小心處理。

的極大興趣光學(xué)顯微鏡是可調(diào)諧二極管激光器的發(fā)展，現(xiàn)在可以在功耗和多功能性方面具有競爭可調(diào)諧染料激光器和摻鈦藍(lán)寶石激光器（下面討論并在圖1所示）。 可調(diào)諧染料激光器具有600至1800納米的波長范圍內(nèi)，并且可以提供5至功率的25毫瓦。 它們具有相對(duì)低的成本，尺寸緊湊，長壽命和低的熱產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)，消除了對(duì)外部冷卻系統(tǒng)的要求。

二極管泵浦固體激光器（DPSS）利用二極管激光器代替惰性氣體，弧光燈，或flashlamps泵固態(tài)激光材料。的功率輸出，光束質(zhì)量和穩(wěn)定性通過二極管泵浦激光器表現(xiàn)出接近于氣體（氦氖）激光的，但效率和大小與二極管激光器更具有可比性。 的二極管泵浦激光器典型的操作和維護(hù)成本小于氣體激光器，和大多數(shù)系統(tǒng)通過對(duì)流或強(qiáng)制空氣或冷卻。

二極管泵浦釹-釔鋁石榴石（Nd：YAG激光器 ）激光器產(chǎn)生毫瓦功率范圍1064-納米光。 倍頻導(dǎo)致了緊湊的設(shè)備與在532納米的連續(xù)波輸出，并且頻率的三倍，也可用于產(chǎn)生一個(gè)脈沖輸出在355納米。 采用二極管激光器陣列發(fā)電的幾瓦1047納米：（YLF Nd）的高功率和效率緊密折疊諧振器（TFR）泵送的釹-釔氟化鋰晶體的開發(fā)。 頻率提高一倍，兩倍，并且在523四倍于這種類型的激光產(chǎn)生的功率輸出高達(dá)幾百相干光毫瓦，349，和262納米（第二，第三和第四諧波）。 二極管激光器作為泵浦源的其他優(yōu)點(diǎn)包括延長的壽命（通常為5000小時(shí)以上，相比之下，幾百個(gè)小時(shí)為燈），準(zhǔn)直的和容易集中輸出的固態(tài)激光器的激射小體積匹配，并且大大激光棒，這通常需要水冷卻時(shí)，鹵素弧光燈作為泵的降低熱負(fù)荷。

二極管泵浦固體激光器的發(fā)展，推動(dòng)了需要高功率（一般為幾瓦）的綠色（532或523納米）和紫外線（355或349納米，266納米的四倍頻）工業(yè)和商業(yè)應(yīng)用波長范圍。 輸出在紫外光譜區(qū)是脈沖，用能量為100微焦耳至10毫焦耳，在納秒級(jí)脈沖持續(xù)時(shí)間和重復(fù)率高達(dá)10千赫。 這些激光器是在顯微鏡非常有用，用于觸發(fā)籠化合物的釋放。 脈沖重復(fù)率，但是，仍然太慢用作照明源的大部分共聚焦顯微鏡的應(yīng)用程序。

進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致的二極管泵浦固體激光器的組合光參量振蕩器（OPO的，參見圖8），以產(chǎn)生一個(gè)可調(diào)，脈沖輸出，從205納米無級(jí)變速至2000納米。雖然最初可用的系統(tǒng)已經(jīng)昂貴和復(fù)雜的操作時(shí)，按比例縮小的版本更適合于顯微鏡的使用正在推出。

摻鈦藍(lán)寶石激光器（俗稱鈦藍(lán)寶石激光器，參見圖1）提供可調(diào)諧的優(yōu)點(diǎn)為脈沖和連續(xù)光傳遞，以及固態(tài)可靠性。這些激光器可以在高重復(fù)頻率（100MHz時(shí)）提供非常短的光脈沖（約80至100飛秒）。可調(diào)諧波長的范圍從遠(yuǎn)紅延伸到近紅外光譜區(qū)（700?1000納米）。大多數(shù)這些激光器是由高功率的氬激光光泵，以及不需要水冷卻操作。由于涉及操作和維護(hù)的Ti的費(fèi)用和復(fù)雜性的結(jié)果：藍(lán)寶石激光器，它們的使用受到了限制主要是為了多光子顯微鏡在相對(duì) 較少的實(shí)驗(yàn)室。

最近，一個(gè)二極管泵浦的Cr：LiSAF（摻鉻鋰鍶氟化鋁）激光已經(jīng)開發(fā)，提供高頻率的90飛秒脈沖在860納米的波長，和88毫瓦的平均輸出功率。小尺寸和鉻的低功耗要求：LiSAF激光器使其代替鈦的一個(gè)有吸引力的光源多光子熒光顯微鏡：藍(lán)寶石激光器。

結(jié)論

其中多光子和激光共聚焦熒光顯微鏡之間的主要區(qū)別是激光在這些經(jīng)常是互補(bǔ)的技術(shù)，使用的類型。激光對(duì)多光子顯微鏡是相當(dāng)昂貴和困難比在激光共聚焦顯微鏡使用的小型風(fēng)冷激光器進(jìn)行操作。

人性化的交鑰匙激光源的多光子顯微鏡的發(fā)展是必要的，如果該技術(shù)是注定要得到廣泛的接受。迄今為止，多光子調(diào)查的范圍是由激發(fā)光波長的限制選擇通過合適的激光照射源提供的限制。為了緩解復(fù)雜的激光日常維護(hù)計(jì)劃，擴(kuò)大有用的激發(fā)波長的光譜，在飛秒時(shí)間的光脈沖激光器的新發(fā)展是必不可少的。具體而言，新的激光源必須設(shè)計(jì)是波長可調(diào)的整個(gè)上部可見的（500 +納米）和光譜的近紅外部分。

在過去的十年中，許多新的短脈沖激光系統(tǒng)的變化是由克爾透鏡鎖模的摻鈦藍(lán)寶石晶體激光器的發(fā)現(xiàn)成為可能。其他新的系統(tǒng)，例如二極管泵浦固態(tài)和單模光纖飛秒激光器正在研究其潛在作為激發(fā)源為多光子顯微鏡。在未來，飛秒脈沖激光由光學(xué)參量振蕩器（倍頻OPO的）可以提供一種通用的解決方案覆蓋有用波長范圍內(nèi)。

激光器在顯微鏡的目前應(yīng)用是在共聚焦顯微鏡，光學(xué)捕獲，和籠形化合物和熒光基團(tuán)的釋放的區(qū)域迅速擴(kuò)大。的緊湊的固態(tài)激光器具有發(fā)射譜線在光譜的藍(lán)色，綠色和紫外區(qū)域的開發(fā)應(yīng)有助于進(jìn)一步提高這些裝置的顯微鏡的利用率。