徠卡顯微鏡共焦光學(xué)截面厚度
共聚焦顯微鏡被用來光學(xué)切片同等厚的樣品。 *直接的問題是:1.什么是“同等厚的樣品”和,2. 有多厚實際上是一種光學(xué)部分? 這兩個問題是相關(guān)的,即厚的樣品是assumedly比光學(xué)切片厚至少大約10倍。
在生物樣品可具有任意厚度為10米(整個動物)至10納米(ULTRACUT準(zhǔn)備用于電子顯微鏡)。 如共焦顯微術(shù)是一種入射光線的方法,所述樣品本身的尺寸可以是幾個厘米或更多,但穿透深度的表面下取決于材料的不透明度和物鏡的自由工作距離。 這就限制了樣本量(Z方向)的考慮到幾毫米在*。
對于光學(xué)切片的決定因素是衍射極限軸向焦點(diǎn)尺寸。 根據(jù)不同的參數(shù),在真共焦掃描顯微鏡的光學(xué)切片厚度達(dá)到降低到約 0.5微米。 厚的樣品相對于0.5微米的切片,然后在5μm以上。 一個非常典型的數(shù)字為用于標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦應(yīng)用(如組織切片),樣本為50微米。
三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)和半*大值全寬度(FWHM)
參數(shù)控制的光學(xué)切片厚度
在理想條件下,*薄的部分可以實現(xiàn)只通過光衍射依賴限制。 *明顯的是波長,它控制的PSF的大小成比例:波長越短,越薄切片。 我們可以假定激發(fā)光進(jìn)行限制(而不是發(fā)射的)的波長,如將沒有被照空間外發(fā)射。 第二個參數(shù)是物鏡(數(shù)值孔徑,NA)的孔徑:較高的NA(收集的信息更寬的角度),越薄的光學(xué)部分。 此外,樣品的折射率影響軸向分辨率并且因此切片性能。 切片的大小DZ對這些參數(shù)的依賴關(guān)系是由公式圖2中給出。(本文來源:徠卡顯微鏡共焦光學(xué)截面厚度)
第三個參數(shù)是針孔直徑在檢測路徑,被假定為零對于上面給出的公式。 因此,這個公式給出誰也無法預(yù)料的熒光成像的*佳價值 - 只是理論上的興趣,當(dāng)然:直徑零針孔不會產(chǎn)生明亮的影像!
光學(xué)截面厚度影響
數(shù)值孔徑NA對切片厚度的顯著(1/square)的影響。 在每平方英尺的徑向延伸線性依賴于NA。 因此,對于低數(shù)值孔徑的透鏡,滌綸短纖核心變得非常長形和切片很厚。 因此,大多數(shù)應(yīng)用程序都使用浸沒透鏡NA> 1,其中xy和z維度的比例接近2個大致的一個因素。 作為一個經(jīng)驗法則,具有高數(shù)值孔徑透鏡的Z部分大約是兩倍的XY分辨率。
理論上的考慮有助于估計光學(xué)系統(tǒng)的性能。 在現(xiàn)實中,這兩種儀器和樣品引入從所計算的數(shù)字偏差。 該儀器必須以獲得*佳性能調(diào)整和精心操作。 和樣品本身就是分辨率的敵人,尤其是如果它涉及到更深層次的成像。 因此格外小心,必須采取折射率匹配,正確的和恒定的溫度和適當(dāng)?shù)纳w玻片的選擇。 該理論將得到一個經(jīng)驗法則,但樣品和設(shè)置可能會引入顯著偏差 - 經(jīng)常無法回避的,因為生物樣品比晶體更復(fù)雜( - 或真空)。