奧林巴斯顯微鏡，標(biāo)準(zhǔn)分辨率和性能問題

 分辨率在光學(xué)顯微鏡通常由光學(xué)單元稱為瑞利判據(jù)，它最初是制定確定的二維望遠(yuǎn)鏡的圖像分辨率的方法進(jìn)行評估，但已蔓延到在光學(xué)許多其他領(lǐng)域。

瑞利準(zhǔn)則是在光從樣本生成的，并且是不依賴于用于產(chǎn)生所述圖像的放大率兩個點(diǎn)源之間的最小可分辨的距離來定義。 在一個二維圖像，兩個點(diǎn)源是可解析的，如果他們的艾里斑的衍射圖案是不同的。 根據(jù)瑞利準(zhǔn)則，兩個緊密間隔的艾里磁盤是不同的，如果他們是距離大于在其中的一個艾里斑的主要最大值與該第一最小值，第二艾里斑（如圖1所示）相一致的距離。 如果該點(diǎn)光源是相等的波長的話，他們的艾里盤具有相同的直徑，并瑞利準(zhǔn)則就等于一個艾里斑的半徑，從它的點(diǎn)的最大強(qiáng)度的測量，以最小強(qiáng)度的第一環(huán)。 對于給定的熒光波長的單色圖像，瑞利判據(jù)可以使用在許多光學(xué)和顯微鏡教科書中的標(biāo)準(zhǔn)公式進(jìn)行估算：

其中d是瑞利準(zhǔn)則，λ是發(fā)射光的波長，NA是物鏡的數(shù)值孔徑。 請注意，d值越小，分辨率越高。

如圖1所示，是在數(shù)學(xué)上由光的兩個點(diǎn)源產(chǎn)生的光強(qiáng)度分布（藍(lán)線）。 該配置文件可以被認(rèn)為是通過艾里斑（實(shí)際上，在焦點(diǎn)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的xy圖像）來表示像素強(qiáng)度沿一條線。 時(shí)的1點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的最大強(qiáng)度的第一極小的另一個重疊的瑞利準(zhǔn)則進(jìn)行解析得到滿足。 對于兩點(diǎn)發(fā)射在同一波長，此間隔距離對應(yīng)于一個單一的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中央亮區(qū)域的半徑（或峰的最小距離）。

上面概述的分辨率公式是用于評估在圖像平面分辨率有用的，但不沿光軸的顯微鏡，信息是成功的分析通過反卷積技術(shù)關(guān)鍵（z軸）。 然而，適當(dāng)?shù)墓接糜谳S向瑞利準(zhǔn)則可以使用類似的推理來推導(dǎo)。 當(dāng)他們的軸向衍射圖案是不同會產(chǎn)生光的兩個點(diǎn)源之間的最小可分辨軸向距離。 這是通過一個事實(shí)，即一個點(diǎn)源的軸向衍射圖案不是圓盤狀，但具有沙漏形狀的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的圖像的光斑或在xz或YZ平面復(fù)雜。 然而，這種沙漏形狀有一個明亮的中心區(qū)域，一樣的艾里斑。 因此，軸向瑞利準(zhǔn)則可以通過利用從最大強(qiáng)度的點(diǎn)的距離，以沿著z軸方向的中央亮區(qū)域的最小強(qiáng)度的第一點(diǎn)來定義。 這個值可以使用下面的公式來估算：

注意，公式包括η，所述安裝/浸沒介質(zhì)的折射率，在分子中。 安裝和浸沒介質(zhì)被假定具有相同的折射率，否則，球面像差導(dǎo)致的分辨率的降低。 讀者也應(yīng)該注意，所有的討論的標(biāo)準(zhǔn)假設(shè)無像差的成像條件下，一種不切實(shí)際的方案在實(shí)踐中。 上面列出的軸向分辨率方程的仔細(xì)研究表明，降低了液浸介質(zhì)的折射率可以提高Z軸分辨率。 然而，這種情況不會發(fā)生，因?yàn)槲镧R的數(shù)值孔徑（也取決于折射率值）被引入具有低的折射率的成像介質(zhì)時(shí)降低。 因?yàn)檩S向分辨率隨數(shù)值孔徑的平方，在物鏡的數(shù)值孔徑的減少遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過通過減少在成像介質(zhì)的折射率來實(shí)現(xiàn)的增益和分辨率受到損害。 通知還在xy平面中的分辨率而變化僅與數(shù)值孔徑的第一電源，而軸向（或z軸）的分辨率與數(shù)值孔徑的平方而變化。 這個重要的區(qū)別意味著，XY分辨率和z軸分辨率都與增加數(shù)值孔徑提高，但Z軸分辨率更可顯著提高。

Z-分辨率是密切相關(guān)但不完全相同的景深的概念。 景深是經(jīng)典定義為標(biāo)本，在焦點(diǎn)顯微鏡的特定焦點(diǎn)設(shè)置出現(xiàn)在最終圖像的厚度區(qū)域。 當(dāng)檢查的二維圖像中，試樣的某一部分被聚焦到一個單一的平面。 出現(xiàn)同樣的作用聚焦在圖像中的功能可駐留在樣品的不同深度。 焦點(diǎn)的定義是有些主觀，但是字段“單元”的一個標(biāo)準(zhǔn)深度通常被定義為一半軸向瑞利單元：

這是偶爾使用，而不是在軸向瑞利準(zhǔn)則另一個標(biāo)準(zhǔn)是在點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中央亮區(qū)的半最大值（FWHM）的整個寬度。 公式估算全寬半值在共聚焦顯微鏡中出現(xiàn)幾個顯微鏡評價(jià)和是相同的，上述的瑞利準(zhǔn)則在寬視場顯微鏡。 應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，這些都是粗糙的表情，讓實(shí)際的估計(jì)。 它們不是嚴(yán)格的分析公式，這需要矢量波理論。

還應(yīng)當(dāng)理解的是，任何分辨率的標(biāo)準(zhǔn)是不分解的絕對指標(biāo)，而是任意的標(biāo)準(zhǔn)是用于比較不同的成像條件是有用的。 瑞利準(zhǔn)則特別適用于其中兩個自發(fā)光的物體必須區(qū)分開來的情況。 在其他情況下，如微分干涉對比（DIC），明場，暗場或顯微鏡，其他條件都將適用。 在一些應(yīng)用中，如移動物體的定位，下面的瑞利極限分辨率是可能的。 這凸顯了一個事實(shí)，即分辨率是任務(wù)相關(guān)的，不能隨意定義適用于所有情況。

另外，分辨率也取決于在很大的程度上圖像的對比度，或?qū)谋尘皡^(qū)分樣品產(chǎn)生的信號的能力。 相反在很大程度上取決于諸如固定品質(zhì)，抗?jié)B透，染色均勻度，熒光褪色，和背景熒光樣品制備技術(shù)。 優(yōu)化的試樣制備方法，可以更為顯著，并以較低的成本比光學(xué)或計(jì)算機(jī)提高分辨率。 然而，假設(shè)一個高質(zhì)量的制劑，適用于任何應(yīng)用的分辨率的限制總是依賴于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和瑞利準(zhǔn)則產(chǎn)生至少在該值的大小的基本處理。

分辨率和對比度的改進(jìn)

內(nèi)時(shí)其解卷積算法是基于原則的框架，它是合理的質(zhì)疑的圖像質(zhì)量何種程度的定量的改進(jìn)可以從迭代解卷積可以預(yù)料的，以及如何最好地評估和比較各種算法的性能。 作出這種評估的一種方法是測量的大小和亮度，前后反褶積，已知大小的測試對象。 圖2給出了從一個subresolution（0.1微米）與利用油浸物鏡（1.4數(shù)值孔徑）一個寬視場成像系統(tǒng)中獲取的熒光珠的圖像堆棧數(shù)據(jù)。 所有像差進(jìn)行了仔細(xì)最小化數(shù)據(jù)收集之前，并且因?yàn)橛须x焦的沒有從任何其他對象信號，該微小珠子代表一個接近理想的樣本用于此目的。

在圖2中，黃線表示的原始圖像數(shù)據(jù)，而紅色線表示由受約束的迭代解卷積恢復(fù)從圖像數(shù)據(jù)。 為了結(jié)垢特性圖中，各強(qiáng)度值已被歸一化到其自身的圖像堆棧的最大值。 如果沒有這樣的歸一化，從原始圖像數(shù)據(jù)也只是勉強(qiáng)地是在圖上可見，因?yàn)榻裹c(diǎn)像素強(qiáng)度是如此的亮得多的恢復(fù)圖像比原始圖像。 每個圖像堆棧的總積分強(qiáng)度，但是，在這兩種情況下是相同的。

量化的迭代解卷積來實(shí)現(xiàn)分辨率的提高，像素強(qiáng)度測定在平行于光軸的線穿過胎圈的中心，前后恢復(fù)。 每個像素的強(qiáng)度進(jìn)行作圖（圖2（a）），歸一化后，如沿z軸從胎圈（0微米）的中心的距離的函數(shù)。 于z軸的強(qiáng)度分布的半最大值（FWHM）處的全寬度取為胎圈的直徑，并測量0.7微米中的原始圖像和0.45微米的恢復(fù)圖像（實(shí)際的對象測量0.1微米）。 由于這個恢復(fù)溫和增長的分辨率只會很少露出一個生物標(biāo)本結(jié)構(gòu)，這不是在原始圖像中可見。

從恢復(fù)所產(chǎn)生的圖像中的一個主要的變化是明顯的，在圖2所示的數(shù)據(jù)（b）中，它表示所有的像素值中的每個焦平面的總和（積分像素強(qiáng)度）為焦點(diǎn)深度的函數(shù)。 對應(yīng)于原始數(shù)據(jù)的曲線（在處理之前）示出了顯著外的聚焦強(qiáng)度在距胎圈2微米的距離。 恢復(fù)迭代反卷積轉(zhuǎn)移大部分失焦的強(qiáng)度恢復(fù)到局灶性起源的飛機(jī)。 其結(jié)果是在圖像的對比度顯著改善，使其更容易解決和圖像中的辨別特征。 在繪制該數(shù)據(jù)，在原料和恢復(fù)圖像棧的每個焦平面上的像素相加的強(qiáng)度進(jìn)行歸一化到平面的圖像堆棧的最大值和最小值。 求和強(qiáng)度繪制為焦點(diǎn)（Z軸）從胎圈中心（0微米）的距離的函數(shù)。 信號強(qiáng)度從外的焦點(diǎn)樣品體積在焦恢復(fù)到產(chǎn)生主要對比度改進(jìn)，以及增加了信號 - 噪聲比。 應(yīng)當(dāng)注意，然而，在整個圖像的積分強(qiáng)度（實(shí)際上，各平面的求和強(qiáng)度之和）是在原料和恢復(fù)的圖像是相同的。

前面的討論概括評估的迭代解卷積算法的性能的一種手段。 的許多可用測定其中的算法，產(chǎn)生最佳的恢復(fù)帶來了另外一個問題了顯微鏡。 一些網(wǎng)站的應(yīng)用比較不同算法的結(jié)果，但這種比較可以被誤導(dǎo)的原因有多種。首先，算法通常由執(zhí)行這些還原合成的球形物體，如用來收集在圖2中給出的數(shù)據(jù)，或理論的對象甚至計(jì)算機(jī)生成的圖像的珠的圖像進(jìn)行比較。 性能之間的關(guān)系，評價(jià)利用測試對象和與實(shí)際生物標(biāo)本表現(xiàn)并不簡單。 此外，除非該比較是定量進(jìn)行，與已知大小的物體，這是難以評估更賞心悅目結(jié)果是否確實(shí)更準(zhǔn)確。 例如，該算法可能侵蝕的特征的邊緣，這使它們更清晰，但混雜測量。

另外一個問題是，算法的比較，通常由出版方有興趣（通常金融）的比較，這使得它們潛在偏見的結(jié)果。 通常情況下，這些政黨比較反卷積算法，其實(shí)現(xiàn)他們已經(jīng)開發(fā)和完善多年，具有即在其最根本的形式實(shí)現(xiàn)非優(yōu)化算法，最初發(fā)表。 然而，如前面所討論的，在速度，穩(wěn)定性和分辨率的改善大的差異可以歸因于一個算法的實(shí)現(xiàn)和優(yōu)化的細(xì)節(jié)。 因此，唯一公平的比較是認(rèn)識軟件包之間，而不是基本的算法之間。

強(qiáng)烈建議去卷積軟件的任何潛在買家比較對自己數(shù)據(jù)的各種軟件包的性能。 這可能需要一定程度的確定，因?yàn)樵S多公司的銷售代表將定期保存圖像的一種專有的文件格式，它往往不能被競爭對手所開'的軟件。 為了比較不同的軟件包復(fù)原后的圖像，有必要做出一定的圖像保存在一個共識文件格式。 目前與最廣泛流通的格式是一個堆棧中的標(biāo)記的圖像文件格式（TIFF）的順序編號的文件，每個代表該三維圖像的焦平面（未突起）。 優(yōu)選的是，有一組可以由各種軟件包被評估被處理示例圖像文件和點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的文件。 采用的算法的評價(jià)自己的圖像和點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于，特定的樣品制備方案中，目標(biāo)，放大，噪聲電平，信號強(qiáng)度，球面像差的存在程度，和其他變量會影響反褶積的質(zhì)量極大。

電腦速度和內(nèi)存使用情況

越來越多的計(jì)算機(jī)處理器速度，安裝的隨機(jī)存取存儲器（RAM），和總線速度的量都增加卷積速度的手段。在去卷積，一個數(shù)字，代表不同形式的圖像的大數(shù)據(jù)陣列被同時(shí)存儲在RAM中，并通過總線周圍移動的計(jì)算機(jī)內(nèi)。 其結(jié)果是，RAM的容量是用于三維圖像的快速處理關(guān)鍵的，因?yàn)槭强偩€速度。 作為一個經(jīng)驗(yàn)法則，圖像處理計(jì)算機(jī)應(yīng)配備至少3倍的RAM作為被去卷積的圖像的大小。 此外，具有快速總線速度的計(jì)算機(jī)性能要好得多，即使名義上較慢的中央處理器。

圖像文件的大小通常報(bào)告的計(jì)算機(jī)的操作系統(tǒng)。 然而，如果這是毋庸置疑的，大小可通過像素的圖像中的總數(shù)量由每像素的字節(jié)數(shù)（被稱為位深度 ）來計(jì)算。 本機(jī)的位深度的圖像的原本由數(shù)字成像捕捉系統(tǒng)，它可以產(chǎn)生每像素8，10，12，或16比特置位。 一旦圖像被獲取時(shí)，位深度由軟件包和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)（; 8比特等于1個字節(jié)，這是幾乎總是8位或16位）來確定。 在彩色圖像中，每種顏色必須被單獨(dú)存儲和去卷積，所以必須小心，以確定比特深度的完整圖像，而不是僅僅為一個顏色通道。 該計(jì)算是如本例所示：三維圖像的堆棧，其中每個面是512×512個像素，含64的光學(xué)面，用三種顏色的每像素8位（或每像素1字節(jié)）測量512×512的×64×3×1 = 50兆字節(jié)（MB）。 圖像文件頭數(shù)據(jù)可能略有增加這個計(jì)算大小。