尼康顯微鏡，落射熒光照明
直到*近，熒光照明只有在配備專門的高數(shù)值孔徑物鏡究級復(fù)合顯微鏡可用的選項(xiàng)。 需要對這種技術(shù)在立體顯微鏡已經(jīng)升級，推出基因編碼和特定的生物熒光蛋白如GFP（綠色熒光蛋白）的。
立體顯微鏡的觀察GFP的應(yīng)用程序現(xiàn)在如此普遍，立體聲熒光照明器更經(jīng)常被稱為GFP的照明 ，即使它們可以用于在生命科學(xué)和電子制造行業(yè)既許多其他應(yīng)用。 大的標(biāo)本，如幼蟲，線蟲，斑馬魚，卵母細(xì)胞，和成熟的昆蟲可以容易地選擇和操縱的時(shí)候都標(biāo)記有綠色熒光蛋白和熒光技術(shù)的照明系統(tǒng)。 熒光照明揭示其生物體產(chǎn)生熒光蛋白和立體視覺連接到的觀點(diǎn)和充足的工作距離大字段允許觀察員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，鑷子，吸管，或顯微操作。 其他更傳統(tǒng)，標(biāo)本也很容易觀察到，用體視顯微鏡熒光照明記錄。
上的方式，類似于那些在更為復(fù)雜的復(fù)合顯微鏡采用體視顯微鏡功能照明的落射熒光。 通常情況下，熒光照明器包括包含在經(jīng)由中間管連接到顯微鏡的外部燈箱氙或汞弧燈（或垂直照明 ，參見圖1和圖2）定位在所述顯微鏡放大的身體和觀測管之間。 這種類型的照明目前僅限于使用共同的主要物鏡（CMO）的立體顯微鏡的應(yīng)用程序，因?yàn)樗褂檬惺鄣牟糠?，以適應(yīng)一個(gè)格里諾或收斂型體視顯微鏡熒光照明是不可能的。
由弧光燈產(chǎn)生的光通過一個(gè)可調(diào)節(jié)集光透鏡引導(dǎo)至容納在組合過濾器塊中的激發(fā)濾光器（如示于圖2和圖3），它允許具有特定波長范圍（或帶通）僅光通過。 經(jīng)過濾的光，然后通過顯微鏡成像路徑的顯微鏡（放大體和在體視顯微鏡物鏡）的下部和上試樣通過一個(gè)二色鏡，這也是調(diào)諧選擇性地過濾，反射和/或發(fā)射一個(gè)特定的偏轉(zhuǎn)設(shè)定波長區(qū)域。 術(shù)語二色性 （或二向色性 ）指的是過濾器或反射鏡的反射由下面指定的波長的顏色的限制，同時(shí)發(fā)送上述限制那些波長的兩個(gè)色彩范圍之間進(jìn)行區(qū)分的能力。
聚焦的激發(fā)光通過顯微鏡放大體和物鏡，在那里形成照明的倒置錐體該沐浴標(biāo)本，令人興奮的任何所存在并具有對應(yīng)于激發(fā)波長的帶通范圍內(nèi)的吸收帶的熒光通過。 從樣品發(fā)射的二次熒光發(fā)射（通常為更長的波長比激發(fā)光）是由立體顯微鏡的共同的主要物鏡捕獲并通過變焦機(jī)構(gòu)，以阻擋濾光器直接返回該塊的激發(fā)波長，并且只允許發(fā)射波長的選定區(qū)域通過。 顯微鏡主體管在圖1和2被構(gòu)造成使得回傳通過左，右放大的光信道波長更長的熒光發(fā)射的光在到達(dá)落射熒光照明器之前獨(dú)立地聚焦。 從左邊的信道的光直接穿過的屏障過濾器被定向到的觀測管或到相機(jī)端口之前。 與此相反，光從右側(cè)通道*行進(jìn)回通過二色鏡，然后在阻擋濾波器和目鏡。 此燈沒有一個(gè)通路到相機(jī)端口，并且只能用于觀察標(biāo)本。
熒光濾光器組合塊的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)在圖2和圖3。 每個(gè)塊包含一個(gè)單一的激發(fā)濾光器，兩個(gè)阻擋過濾器和一個(gè)二色鏡。 由汞弧燈產(chǎn)生的光入射到塊通過激發(fā)濾光片，由二色鏡的表面反射，如上面所討論和圖3所示。 次級熒光發(fā)射通過屏障過濾器通過。 激發(fā)濾光器，二色鏡，和用于左聲道的屏障過濾器是粘到的地方，但在阻擋濾波器用于右聲道被安裝在一個(gè)小的幀，可以從塊松開一組固定螺釘被刪除。 卸下屏障過濾器框架允許訪問的二色鏡設(shè)置在過濾器塊的內(nèi)部。當(dāng)涂膠更換過濾成塊，注意不要鋪膠附著在過濾器表面，不要按住過濾器或雙色鏡沒戴手套的手，以避免污染與油膩指紋的表面。
熒光垂直照明可同時(shí)容納三濾塊和一個(gè)直徑過濾器偽字（不含過濾器），使正常的明場觀察。 濾波器塊被安裝在一個(gè)滑動(dòng)齒條，并且可以由被利用來控制齒條位置的桿的裝置被插入到光路中。 每個(gè)塊具有可插入的槽上按順序以使操作者能夠容易地選擇用于熒光觀察的正確塊的照明器外部殼體伴隨的標(biāo)識牌。
目前，尼康提供了一個(gè)溫和的陣容過濾器的組合，其中列于表1。 這些過濾器涵蓋范圍廣泛的熒光激發(fā)和發(fā)射條件，并且應(yīng)該是許多生物學(xué)研究中常用的熒光探針有用的。 該過濾器的組合也適合于工業(yè)應(yīng)用，如檢查通過熒光照片集成電路晶片的污染的抗蝕劑的聚合物。 熒光探針，激發(fā)波長380和510納米之間的范圍可以通過選擇合適的激發(fā)/發(fā)射過濾器組合（見表1）予以確認(rèn)。 該過濾器的組合也可用于研究使用各種綠色熒光蛋白的突變體，包括青色和藍(lán)色版本相當(dāng)有用的。
在活具有熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)物中，信號強(qiáng)度可以被顯著當(dāng)過濾器組合被審慎相匹配的熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射輪廓改善。 例如，在DS-紅信號，視覺和圖像傳感器檢測的紅色熒光的情況下，可以顯著地由紅色信號轉(zhuǎn)移到更橙色發(fā)射的提高。 此外，專為具有葉綠素強(qiáng)烈的自發(fā)熒光背景輻射的植物標(biāo)本過濾器組合常常受益于謹(jǐn)嚴(yán)選擇的過濾器規(guī)格就相應(yīng)的信號發(fā)射。 顯微鏡工程師采取許多這些設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)納入考慮時(shí)，他們優(yōu)化的波長帶通區(qū)域的立體過濾器組合。
體視顯微鏡熒光濾光片組合
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表1
與其它敏感干涉濾光片，所述組合塊過濾器將隨時(shí)間暴露于高強(qiáng)度的光及紫外線的波長惡化。特性，如帶通頻率和透射數(shù)值也將受到影響，如果過濾器被暴露在高濕度的條件。 為了增加這些過濾器的使用壽命，應(yīng)保存在干燥器中或含干燥劑的密封容器中。 此外，減少時(shí)間的光被通過保持照明快門穿過過濾器的金額關(guān)閉時(shí)的標(biāo)本沒有被直接觀測或拍攝用數(shù)碼或膠片相機(jī)系統(tǒng)。 該濾波器只能用從耳朵氣球，軟camelhair刷，或無油的加壓氣瓶的干燥空氣進(jìn)行清潔。 永遠(yuǎn)不要試圖擦拭過濾器的表面與鏡頭紙，以避免造成劃傷或擦傷進(jìn)入軟干擾涂層。
各式各樣的標(biāo)本可以在熒光照明成像用立體顯微鏡，如尼康SMZ1500。 隨著0.5倍1.6倍，通過與15倍變焦范圍物鏡放大倍率，顯微鏡能夠提供4倍的總放大倍率廣度540X，采取立體顯微鏡觀察范圍成經(jīng)典復(fù)式顯微鏡的。 放大這個(gè)很大的自由度使顯微鏡圖像兩個(gè)大客廳標(biāo)本和存在于熒光標(biāo)記的被安裝在顯微鏡玻片上薄切片微小的細(xì)節(jié)。 在高倍率范圍內(nèi)的熒光觀察的例子示于圖4為小鼠腎組織的三重標(biāo)記的厚部。 將試樣用DAPI標(biāo)記的Alexa Fluor 488的WGA，和Alexa Fluor 568（的的Alexa Fluor探針和樣品購自Molecular Probes公司獲得），并使用表1中列出了三個(gè)過濾器的組合進(jìn)行成像： 藍(lán)綠色熒光蛋白/ DAPI，賦予GFP的帶通 ，和TRITC紅色熒光蛋白 。 此圖片清楚地說明了熒光立體顯微鏡的高倍率能力，觀察原先的復(fù)合顯微鏡制備標(biāo)本。
其他體視顯微鏡制造商提供的熒光激發(fā)和觀測的替代照明策略。 *流行的配置，如圖5所示，包括一個(gè)外部途徑的熒光激發(fā)，不利用顯微鏡的成像光學(xué)系統(tǒng)。 從電弧燈箱照明是通過激發(fā)濾光片首先通過，然后通過設(shè)置在主顯微鏡主體后部的管引導(dǎo)。 在管的下部裝有一個(gè)透鏡系統(tǒng)，指示激發(fā)波長到標(biāo)本。 此配置可確保光線被直接引導(dǎo)到標(biāo)本在所有放大倍率變焦位置，提供一個(gè)均勻深色背景在所有放大倍率同樣強(qiáng)烈的熒光照明。
從標(biāo)記的樣品次級熒光發(fā)射是由共同的主要物鏡（圖5）捕獲并通過變焦頻道和成一組定位在所述顯微鏡頭屏障過濾器通過。 從那里，光被引導(dǎo)到目鏡直接觀察或成攝像管用于數(shù)字成像或顯微攝影。 這種結(jié)構(gòu)的主要優(yōu)點(diǎn)是由于缺乏對二色性反射鏡的需求，以及一個(gè)獨(dú)立的從預(yù)先配置的過濾器的組合塊，其允許在過濾器選擇的研究者稍寬緯度。 但是，配置也可導(dǎo)致無經(jīng)驗(yàn)的運(yùn)營商誰試圖觀察標(biāo)本不正確的過濾器組合錯(cuò)誤。
通過汞弧光燈產(chǎn)生和利用作為在熒光顯微鏡激發(fā)源的強(qiáng)烈的紫外線輻射可能損壞觀察者的眼睛的視網(wǎng)膜上。 為了避免這種情況，許多顯微鏡制造商包括能過濾紫外線沐浴在顯微鏡載物臺標(biāo)本在顯微鏡體保護(hù)裝置。 其他的安全預(yù)防措施，包括在觀察路徑和周圍的燈箱雜散光防護(hù)紫外線阻隔過濾器。 此外，虛擬運(yùn)營商過濾器經(jīng)常插入滑塊和設(shè)計(jì)的熒光干涉濾光片旋轉(zhuǎn)框無人居住的過濾器的位置。
熒光立體顯微鏡通常配有一個(gè)光停止定位在汞燈箱和垂直照明器來阻止來自燈有害的紫外線輻射時(shí)，試樣不被觀察或成像之間的某處。 這個(gè)站應(yīng)該總是被插入到光路中時(shí)，觀察不被進(jìn)行。
反射，或熱點(diǎn)可以在熒光立體顯微鏡使用較高的放大倍數(shù)復(fù)消色差物鏡（1.6倍至2.0倍），觀察試樣時(shí)出現(xiàn)在視場的下部。 這神器通常是*可見在較低的縮放比率，往往消失時(shí)的變焦倍數(shù)增加。 在大多數(shù)情況下，反射性的問題不與較低倍物鏡（0.5倍和1.0倍）發(fā)生，而不管光學(xué)校正因子，并且通常是從低級校正（消色差透鏡和平場消色差透鏡）的高倍率物鏡缺席。
存在范圍廣泛的用于利用立體顯微鏡熒光勘測應(yīng)用中，如在表2中給出。 的受益于該觀察模式標(biāo)本的數(shù)量是相當(dāng)大的，涵蓋廣泛的學(xué)科范圍包括從生物領(lǐng)域的工業(yè)制造商。
熒光立體顯微鏡應(yīng)用
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表2
熒光觀察的立體顯微鏡相比，由經(jīng)典復(fù)式顯微鏡呈現(xiàn)的視圖提供的三維觀測的**屬性。 此外，更大的工作距離和場由立體技術(shù)得到的深度使之視圖和更強(qiáng)烈的熒光更寬的全景字段。這些功能都是巨大的利益調(diào)查誰正試圖處理大量的生物標(biāo)本和材料的技術(shù)人員正在開展前期準(zhǔn)備工作，如嵌入，電子檢查，或切割。 隨著越來越多的明確定義的過濾器組合成為可用于專業(yè)應(yīng)用，在立體顯微鏡采用熒光應(yīng)繼續(xù)攀升。