徠卡顯微鏡，相干反斯托克斯拉曼散射顯微與細(xì)膩樣品成像
熒光顯微鏡假定在細(xì)胞生物學(xué)中的關(guān)鍵作用，一旦有可能通過熒光染料選擇性地染色的細(xì)胞成分。一個有針對性的染色，保羅·埃爾利希的*個探險家，有想法的東西，專門污漬也應(yīng)該殺了明確 - 這是與術(shù)語“靈丹妙藥”，化療的基本思想有關(guān)。他的研究小組發(fā)現(xiàn)灑爾佛散，抗梅******物量身定做 - 雖然不夠具體，沒有造成重大的副作用。篩選許多熒光染料導(dǎo)致染色這是在組織學(xué)使用，包括像染料DAPI或蘇木精伊紅一長串。
在具體的染色**發(fā)起的引入抗體介導(dǎo)的免疫組化染色和DNA雜交為基礎(chǔ)的染色。這允許一個單一的蛋白質(zhì)或DNA序列被龐大而無法與經(jīng)典的化學(xué)染料分化的化學(xué)性質(zhì)相似的分子背景高亮顯示。在這方面，*近的重要進(jìn)展已取得的熒光蛋白。這些被引入到染色的結(jié)構(gòu)，分子與細(xì)胞或在傳感器為代謝物，離子和其它物種中的活細(xì)胞和有機體，以提供用于觀察生命的機械的一個窗口被用于 - 在實時模式。然而，所有這些染色程序涉及更多或更少侵入性的干預(yù)措施，并要求在許多情況下死亡或固定的準(zhǔn)備工作。此外，該熒光蛋白的方法取決于外源蛋白在靶細(xì)胞中表達(dá)，通常顯著與在細(xì)胞中的靈敏調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)干擾。因此，方法進(jìn)行了探索，使笨重的樣品的成像沒有任何污染。
圖1：左：本土化研究和檔次脂質(zhì)在不同類型的巨噬細(xì)胞積聚的：脂類綠色，63×物鏡顯示為紅色，肌動蛋白。來自：Alba Alfonso Garcia and Jeff Suhalim 美國加州大學(xué)Potma實驗室。細(xì)胞：阿德爾海德求Kratzer博士，醫(yī)學(xué)系肺科和臨界指數(shù)的護(hù)理，科羅拉多大學(xué)。右：兩個錄音從三明治醬疊加圖像：脂質(zhì)顯示為紅色，水綠色，25倍的目標(biāo)，比例尺為25μm。
圖2：散射過程。Y：瑞利散射。S：斯托克斯散射。答：反斯托克斯散射。（G：基態(tài)與振動子狀態(tài)，E：激發(fā)態(tài)與子狀態(tài)，V：虛擬狀態(tài)）。
瑞利和拉曼散射
光能夠與物質(zhì)不僅通過吸收光子接著分子假設(shè)較高激發(fā)態(tài)相互作用，而且還通過假設(shè)所謂的“虛態(tài)”。在這種情況下，光子不具有能量量子能適合任何給定的分子中的狀態(tài)的差異。出于這個原因，所釋放的光子不斯托克斯位移，因為沒有熱子狀態(tài)系列中的虛擬狀態(tài)，可能導(dǎo)致排放轉(zhuǎn)移到紅（熒光，激發(fā)態(tài)先迅速放松到的*低振動子狀態(tài)興奮狀態(tài)，釋放熱能而離開發(fā)射的光子具有較少的能量 - 偏紅色調(diào)）。在正常條件下散射，入射和散射光子，因此具有相同的能量，這是相同的顏色，并且不能從相互作用的分子，攜帶任何特定信息。此標(biāo)準(zhǔn)的情況下被稱為“瑞利散射”（圖2：Y）。
然而，有一種可能性，發(fā)射不覆蓋整個跨度到該分子的*低振動狀態(tài)，但是，例如，能量只返回到*熱狀態(tài)。在這種情況下，所發(fā)射的光子不僅缺乏的是熱態(tài)的能量差到基態(tài)。發(fā)射紅移。這種現(xiàn)象被稱為拉曼散射（這里，斯托克斯散射，參見下面的替代方案，圖2：S）。因為這些子狀態(tài)的能量差是非常特異的分子結(jié)構(gòu)，事件和釋放的光子之間的能量差表明，在與光相互作用的化合物的詳情。因此，拉曼光譜已成為分析化學(xué)一個非常有用的工具。另外，該分子可能只是碰巧居住在振動狀態(tài)（這在一定程度上會發(fā)生，即使在環(huán)境溫度）。在此情況下，在照明的虛擬狀態(tài)是更高相比上面所討論的例子。作為發(fā)射后的分子通常會假定為*低能量，散射光子具有更高的能量大于入射光子。這被稱為反斯托克斯散射（圖2：A）。這兩個過程很少發(fā)生;斯托克斯過程約10 -3 -10 -4小于瑞利過程倍，且反斯托克斯過程甚至一個或兩個數(shù)量級低于。對于成像，自發(fā)拉曼散射的效率是**為止太低，以產(chǎn)生合理的時間內(nèi)足夠的信號。
圖3：一個反斯托克斯拉曼信號，以產(chǎn)生足夠的信號用于化學(xué)成像的擴增。詳細(xì)信息請參見正文。
反斯托克斯拉曼信號的放大
為了產(chǎn)生拉曼光子的強度的有用的，這是必要的，人為地增加的*振動狀態(tài)的人口。當(dāng)達(dá)到這一目的，許多光子會散發(fā)在反斯托克斯波長，產(chǎn)生可測量的信號。
為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，強烈紅外光束（泵浦光束）*初通過使用標(biāo)準(zhǔn)脈沖高功率紅外激光聚焦到樣品上。這束將促進(jìn)許多虛擬狀態(tài)中分子的集合體。為了避免他們的回歸到零振動能級，第二束照射（探測光），刺激從虛擬狀態(tài)的回歸，就像一個STED光束返回激發(fā)態(tài)到基態(tài)。如果第二光束被調(diào)諧到與*振動狀態(tài)（表示該能量必須泵浦光束和振動能量的差）完全匹配，則該分子將不承擔(dān)零電平處于基態(tài)。因此，許多分子中的焦點已經(jīng)晉升到振動狀態(tài)。第二激光器是可調(diào)諧紅外激光，和現(xiàn)代系統(tǒng)使用的復(fù)合設(shè)備，提供同軸兩種波長。
這兩個過程或多或少同時發(fā)生。兩種波長需要照射樣本。因此，當(dāng)泵浦光束仍是上，所述分子可以假設(shè)較高的虛擬狀態(tài)下，從*振動基態(tài)開始關(guān)閉。他們將在這個虛擬的狀態(tài)放松到基態(tài)的零子狀態(tài)，從而發(fā)射出光子能量高于泵束的高。所不同的是*熱狀態(tài)完全相同的能量。所有我們需要做的就是收集這些散射光，并從泵和探測光束分開。這是沒有必要的，以適應(yīng)發(fā)射帶通濾波器的反斯托克斯波長，作為特定信號是由填充了大量的熱狀態(tài)是特定于所討論的化合物（圖3）的制備。的特定信號是泵和探針，其具有被調(diào)諧來選擇所需的化合物之間的差異。
事情，我們現(xiàn)在可以看到
作為熱能源關(guān)聯(lián)非常特別具有化學(xué)鍵，能夠進(jìn)行本地化的樣品在不同的鍵類型。對比度是根據(jù)特定熱激發(fā)和信號將規(guī)模與化合物的濃度。CH-CH鍵高度集中于脂質(zhì)雙層和其它非極性結(jié)構(gòu)。因此，它可以對圖像的極性（主要是水）的背景脂質(zhì)區(qū) - 無任何熒光染色程序。這已被證明是與許多類型的樣品很成功。整個生物體，像果蠅胚胎，成蟲和組織樣本，細(xì)胞，甚至活酵母細(xì)胞變得可見，沒有任何染色過程。在具有快速掃描系統(tǒng)，例如，在Leica TCS SP8車的共振掃描器結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)的秘密可以在生理條件下進(jìn)行監(jiān)控。食物樣本可以檢查組件的脂水分配和龐大的應(yīng)用范圍是開辟了聚合物的研究和產(chǎn)業(yè)。