尼康顯微鏡，熒光共聚焦顯微鏡的關(guān)鍵方面
我們都知道，熒光顯微照片揭示了在組織中的分子標(biāo)記的位置，對不對？好吧，也許不是。 事實上，你可以很確定，在熒光模式大多數(shù)激光掃描共聚焦顯微鏡測量的是在某一特定時間所收集的光子數(shù)的某些功能。 我們希望這是一個或兩個有趣的參數(shù)的精確測量 - 局部分析物的濃度或局部離子濃度。 事實上，許多因素會影響實際存儲在計算機(jī)存儲器中在任何給定時刻的數(shù)值。
一個通用的激光掃描共聚焦顯微鏡示出了一些在本文中提及的“39”特征的位置的流程圖示于圖1。 示的系統(tǒng)是基于配置為活細(xì)胞成像的倒置光學(xué)顯微鏡。 在下面的文本稱為單個組件被標(biāo)記為與至（g）的字母（a）所示。 該圖示包括三個光學(xué)部分，在不同的高度，通過抗體標(biāo)記的果蠅胚胎采取沿z軸，并指定Z1，Z2和Z3。
多年來，學(xué)生參加活細(xì)胞的三維顯微各月期間舉行，英屬哥倫比亞大學(xué)，編譯這些外在因素的清單。 在*年中，列表增加至39項，所以我們借用了希區(qū)柯克電影的名字為我們的名單。此后，名單繼續(xù)成長！ （在球場上的更多信息可以在網(wǎng)絡(luò)上在被發(fā)現(xiàn)的3-D顯微鏡課程公告板 ）。
雖然這篇文章不能完全描述每個學(xué)期，短暫的和有用的解釋也包括在內(nèi)。 該條款出現(xiàn)在粗體字和粗體字等許多方面交互。 請注意，許多這些變量通常是在其對空間分辨率的影響來考慮的。 他們在這里列出來，因為降低的分辨率轉(zhuǎn)換成“把精彩的光子數(shù)相同到一個更大點”。 這降低了激發(fā)強(qiáng)度 - 通過給定的分子中產(chǎn)生的光子的數(shù)目 - 和這些檢測到的級分。 人們常常忘記，在熒光共聚焦顯微鏡正常信號電平對應(yīng)于只有10-20光子/像素的亮區(qū)域。 在這種情況下，統(tǒng)計噪聲是空間分辨率比由阿貝式定義的更重要的局限：
dmin = λ0 / (NAobj + NAcond)
在公式中，D（分）表示在一個周期光柵，可以只是被解析的*小間距，并且被表示為在試樣空間橫向距離，λ（0）為光的波長在真空;和NA(obj)和NA(cond)是的物鏡和聚光透鏡的數(shù)值孔徑，分別。 該方程確定了物鏡和聚光鏡的數(shù)值孔徑在確定圖像分辨率為光的給定波長的作用。
激光單元 （圖1（a））是照明光源，并且在一般情況下，測得的熒光是成正比的激光功率電平。 雖然總的激光輸出功率通常調(diào)節(jié)，功率是在多行激光的每一行的值可能無法，也可以廣泛地隨時間變化。 波長影響光學(xué)性能，而且通過該染料的吸收光譜，它決定了熒光的產(chǎn)生量。
功率輸出不穩(wěn)定通常是噪音，它的不穩(wěn)定性通常小于1％，但隨著年齡的激光可以變得越來越不穩(wěn)定。 因為灰塵，未對準(zhǔn)，或機(jī)械不穩(wěn)定性可導(dǎo)致10-30％的隨機(jī)變化， 光學(xué)耦合到所述連接光纖（如果使用的話）是至關(guān)重要的效率 。
激光反射鏡對準(zhǔn)和反射特性可以是長期漂移在源代碼中的激光輸出。 由于激光的光源是由激 光反射鏡來確定， 波束指向誤差和/對齊是很重要的。 不穩(wěn)定這里將顯示為亮度變化，因為變化的視在源的位置將改變耦合激光光線進(jìn)入單模光纖中大多數(shù)儀器中使用的光學(xué)器件的效率。
物鏡 （圖1（b））的數(shù)值孔徑的影響通過可收集樣品發(fā)出的光的分?jǐn)?shù)。 這也適用于光從激光。
物鏡放大倍率是負(fù)相關(guān)的物鏡入射光瞳的直徑。 該目標(biāo)將只有正常工作，如果整個入瞳充滿了令人興奮的激光。 填充不足會降低空間分辨率和強(qiáng)度的峰值。 載入過多會引起一些激光罷工客觀的金屬安裝和丟失，也減少了光斑的強(qiáng)度。
清潔度是很重要的，并且臟光學(xué)產(chǎn)生更大和調(diào)光斑點。 傳輸 （光入射，可以聚焦到一個點上它的另一側(cè)的物鏡的分?jǐn)?shù)）隨波長而變化。 提防使用一些較新的，多層光學(xué)在紅外范圍內(nèi)的。 色差和球面像差都使光斑變大，并且隨波長。 此外，球面像差與蓋玻片的厚度和浸漬并包埋介質(zhì)的折射率變化很大。
衍射是不可避免的限制的光學(xué)分辨率。 它有效地放大物體比衍射極限較小的圖像，使它們顯得暗淡比他們應(yīng)該的。
掃描系統(tǒng) （圖1（c）），尤其是縮放倍率的控制，決定了一個象素中的試樣的尺寸。 對于Nyquist采樣，像素應(yīng)該比你希望看到在你的樣品的*小功能小至少兩次。 假設(shè)200納米的瑞利準(zhǔn)則的分辨率，像素應(yīng)該是小于100納米。 較大的生產(chǎn)欠，減少小功能所記錄的亮度。
漂白率的影響正比于變焦倍率的平方。 為掃描速度 ，較長的停留時間在一個特定的像素，所述多個信號將被檢測到，并在減它將由泊松噪聲失真。 在高掃描速度下（小于100毫微秒/像素），從染料的熒光衰減常數(shù)的長度*過這一停留時間信號可以被減少。
光柵尺寸 -連同變焦倍率，沿著柵格的邊緣像素的數(shù)目將確定的像素尺寸。 更多的像素（1024×1024與512×512），使欠采樣的可能性較小，但意味著一個人必須要么花費更少的時間在每個像素通過減少收集光子的數(shù)量，增加泊松噪聲，或需要更多的時間來掃描大圖和可能導(dǎo)致更多的漂白。 光學(xué)或掃描鏡可以引入幾何失真 ，可能導(dǎo)致物體的形狀和所述圖像之間的不一致。 環(huán)境是很重要的：振動和雜散電磁場可以通過多種設(shè)備引起的，例如，冷卻風(fēng)扇。這可能會導(dǎo)致產(chǎn)生扭曲，可能會隨時間變化不正當(dāng)鏡偏轉(zhuǎn)。
其他光學(xué)元件包括傳輸 ，它描述不存在于光學(xué)元件，特別是中性密度或帶通濾波器，分束器和目標(biāo)的吸收和反射損失的量度。 思考從空氣/玻璃界面通常表示丟失的信號，但可能會出現(xiàn)亮點無關(guān)樣本結(jié)構(gòu)。 鏡面反射率可以是波長的強(qiáng)功能的紅外線和紫外線，并降低暴露在潮濕和灰塵。
蓋玻片的厚度是*昂貴的光學(xué)組件和*有可能被不小心選擇。 它應(yīng)該是170±5微米的厚度。作為浸油 ，其折射率必須完全匹配所用的物鏡。 這可能只發(fā)生在一個小的溫度范圍內(nèi)，以及可選地，它可以是自定義的混合。 聚焦平面上的位置是重要的，因為略高于或焦點的平面之下的特征會出現(xiàn)比在焦點平面的特征的調(diào)光器。 當(dāng)收集的三維數(shù)據(jù)，奈奎斯特采樣，還必須實行的z軸的平面的間隔。 *后， 該階段的機(jī)械漂移可導(dǎo)致實際成像隨時間變化的對象的平面。
感興趣的染料的濃度可能是你正在試圖測量。 滲透入試樣往往是離子強(qiáng)度和pH值的函數(shù)（或從空間排阻）是什么。 的吸收截面是令人興奮的光子通量，這將通過染料分子被吸收的分?jǐn)?shù)的測量。 它是由共軛探頭，pH值，特定離子的濃度和離子強(qiáng)度的方法的影響。
量子效率描述了機(jī)會，能量從一個激動人心的光子吸收將被重新輻射的熒光光子。 它是波長的強(qiáng)函數(shù)，并且還受pH值，特定的離子濃度，離子強(qiáng)度和染料-蛋白質(zhì)相互作用。當(dāng)激光功率大于1毫瓦使用具有高數(shù)值孔徑的物鏡時單線態(tài)飽和 。 然后，光的強(qiáng)度足以將大部分接近交叉的染料分子進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，從而減少了有效的染料的量子效率。
裝載是指染料的你把你的細(xì)胞數(shù)量。 重要的變量包括染料分子/抗體的數(shù)量，或者其它蛋白質(zhì)標(biāo)記，并用于固定/透化協(xié)議。 猝滅是由附近的其他人從1染料分子發(fā)出的熒光的吸收。 卸載是指染料，這是在細(xì)胞內(nèi)，但是現(xiàn)已泵出或以其它方式失活。
底物反應(yīng)的稅率適用于染料與那些與他們的互動與細(xì)胞離子或其他分子的熒光性質(zhì)。 像素的駐留是微秒數(shù)量級上，因此有可能沒有足夠的時間以達(dá)到平衡。 預(yù)漂白是指染料的脫色本測定之前進(jìn)行即可。
條塊是染料的細(xì)胞內(nèi)過程的重新分配。 染料/染料的相互作用不僅指剛才提到的淬火，而且還對熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。 發(fā)生這種情況時，一種染料的發(fā)射光譜與第二染料分子的吸收光譜重疊，幾納米的路程。FRET可導(dǎo)致光的僅在第二染料的發(fā)射波長的發(fā)射。 如果第二分子不是熒光的，如通常發(fā)生的，熒光丟失或淬滅。 染料對試樣的影響，可能會影響許多環(huán)境變量，包括樣品的生存力的降低。
試樣 （圖1（d））和它的嵌入介質(zhì)的折射率，將決定的球面像差存在的嚴(yán)重程度。 即使是觀看使用水目標(biāo)水生物標(biāo)本，對手是不可能做到**，甚至接近。 這種類型的球面像差是隨著穿透深度的信號損失的主要原因。
它必須使用的浸油具有正確的折射率和色散（與波長的折射率的變化）。 同時，要確保沒有氣泡，將作為在沉浸介質(zhì)中間的鏡頭。 檢查通過集中上下同用于調(diào)整你相環(huán)的勃氏鏡。
試樣的重要狀態(tài)可以影響的實驗的結(jié)果，因為，例如，將死的細(xì)胞具有不同的形狀，大小和離子的環(huán)境中不是活的。 自發(fā)熒光是指內(nèi)源性熒光化合物的存在。 這些分子的效率可與pH值，離子濃度和代謝狀態(tài)而有所不同。 額外的自發(fā)熒光可以通過固定不當(dāng)使用戊二醛特別是當(dāng)生產(chǎn)。
目標(biāo)和重點的平面之間折光結(jié)構(gòu)或細(xì)胞器，例如，脂質(zhì)球形球，可能會重新聚焦光束到一個完全未知的位置。 更小的特征可以具有較小的影響，但該光散射出來的光束的任何折射的功能將降低檢測信號的激發(fā)點，因而強(qiáng)度。 它們的累積效應(yīng)也加起來具有折射率比水高得多的細(xì)胞。
存在或不存在高度染色的結(jié)構(gòu)的上方或下方的聚焦平面指的是z軸分辨率是有限的。 大型結(jié)構(gòu)還可以吸收大量的令人興奮的光，如果高度染色。
穿過針孔 （圖1（e）），該信號正比于針孔的直徑的平方（或它的大小 ），它通常被設(shè)置為等于艾里斑處的平面內(nèi)的直徑針孔。 對齊是很重要的，并且被聚焦到試樣，然后通過光學(xué)系統(tǒng)重新聚焦回到激光器的圖像應(yīng)該與針孔的中心重合。
檢測器 （圖1（F））通常為光電倍增管（PMT）。 檢測到的信號是成正比的量子效率 。在大多數(shù)共聚焦儀器中使用的光電倍增管的有效量子效率從約15％下降到在藍(lán)端在光譜的紅色端約4％。 至于響應(yīng)時間 ：大多數(shù)的熒光信號，能夠迅速被放大，但探測器他人，如跨膜電流，響應(yīng)速度很慢，使得慢掃描速度必要的。
光電倍增管的電壓決定了光電倍增管的放大。 50伏的增加對應(yīng)于約2更在增益因子。 要注意的是光電倍增管的黑電平或（亮度）控制允許任意數(shù)量的加法或減法從提出到數(shù)字化的信號。 黑電平應(yīng)該被設(shè)置成使得在圖像的*暗部分的信號電平是5-10的數(shù)字單元。
有噪聲的許多可能的來源，都將扭曲的入賬價值。 通常情況下，光電倍增管產(chǎn)生的暗電流噪聲相比，信號電平是很小的。 然而，這是被允許變熱或查看很差染色標(biāo)本時紅敏光電倍增管不假。 除了從任何雜散光，可能無意中到達(dá)光電倍增管，主要剩余噪聲源是泊松或統(tǒng)計噪聲。 這等于記錄在一個給定像素的光子數(shù)的平方根。 其結(jié)果是它變得更大以較高信號電平，即使信號與噪聲的比率提高。
數(shù)字化 ，通常使用的計算機(jī)（圖1（克））應(yīng)該是線性的。 提交的“8位”顯微鏡的數(shù)字化裝置的電子信號必須是大小介于1和255之間要被記錄的。 由于統(tǒng)計噪聲，介于10和220的值是更安全的。 數(shù)字轉(zhuǎn)換系數(shù)是指檢測并存儲該數(shù)的光子數(shù)之間的比率。 這依賴于光電倍增管的電壓和其它電子增益，但通常為約30，用于記錄在8位儀器正常標(biāo)本。
記住，要衡量這些因素精確，必須持有其他38不變。 祝你好運！