徠卡顯微鏡，超高分辨率顯微鏡和三維測量
光學成像裝置有一個有限的深度字段和衍射限制的分辨率。 首先處理場問題的深度與激光共聚焦顯微鏡衍射無限的分辨率已經(jīng)可用了幾年，現(xiàn)在用*分辨率顯微鏡。 現(xiàn)已*分辨率顯微鏡領域的問題與解決深度。本地化*分辨率使用散光基Z-編碼。 STED*分辨率采用了一種混合相位掩模在橫向和軸向尺寸可調(diào)的*分辨率的概念
光學切片
經(jīng)常被視為我 們的感官中*令人印象深刻的視覺感知。 已作出了許多嘗試，保留光學印象-或提高他們增加樂趣。 光學成像器件有一個惱人的缺點，雖然成像銳利的范圍是有限的。 這種有限的范圍被稱為“景深”。 盡管我們的眼睛具有相同的限制，我們的大腦意味著巧妙地過濾尖銳部分的整體形象進入我們的意識。 我們認識到，*新的欺詐，如果我們看一張照片和納悶為什么有銳化地區(qū)。
在光學顯微鏡的景深相對比較淺，尤其是如果我們的物鏡是記錄高分辨率圖像。還有一直嘗試增加的景深-擺脫鈍化貢獻。
解決了這個問題，在過去通過切片成相當薄的切片樣品-厚度小于景深。 這些樣品沒有表現(xiàn)出任何的重點貢獻。 但他們也沒有一個人試圖了解的對象的結(jié)構(gòu)完整性。 重建一個三維視圖的對象，例如一個單元格或一個小的有機體，一個有切一個大系列的*薄切片，然后組合所記錄的圖像。 這個過程顯然是相當繁瑣，且切割往往會導致嚴重變形，阻礙正確的重建。
一個更好的方法就是所謂的“共聚焦顯微鏡”。 共聚焦顯微鏡刪除不屬于任何貢獻，景深的光學裝置，其*突出的部分是“針孔檢測”。 為了生成一個三維的重建，這是足以遞增的聚焦位置的焦點深度的一半左右，并通過適當?shù)能浖?，所記錄的圖像合并。 在過去的20年中，這種方法已經(jīng)成為一個標準的程序在生物成像
第二種方法有異曲同工之妙的是多光子顯微鏡，在這里，光學切片發(fā)生由非線性效應激發(fā)的熒光分子，只有一薄層。
圖 1：共焦掃描顯微鏡的光路。 雖然光輻射從z方向中的所有層中，只有一個單一的焦平面轉(zhuǎn)移到檢測器。 從上面和從下面的焦平面上的光有效地除去由針孔，作為空間濾波器。 OL，物鏡的鏡頭：BS，分束器，PH值，針孔。
更好的Z-分辨率：4PI
天然的限制，常規(guī)的顯微鏡是收集來自樣本的光的事實，只從一側(cè)。 從一個單點，只有一個半球體圖像重建做出貢獻。 此半球?qū)?P的立體角。 如果有可能，操作上在試樣的兩側(cè)的兩個相對的透鏡，理論上的可覆蓋的立體角應便士，因此4PI顯微鏡。在實踐中，*大的一個可以覆蓋單個透鏡是約 1.3 p和4PI顯微鏡實際上是在2.5 p顯微鏡。 在4PI顯微鏡，樣品被夾在兩個蓋玻片之間，并且它必須是足夠薄以留出空間，用于聚焦。 因此，厚度*過50微米的樣品通常是不適合4PI顯微鏡。 從兩側(cè)的相干照明創(chuàng)建一個密閉的強度，可以允許在軸向方向上的分辨率大約為100nm的層。 這是5-10倍，更好的比較在一個經(jīng)典的共聚焦顯微鏡的軸向分辨率。 雖然的長期4PI顯微鏡建議增加了一倍的分辨率，橫向的表現(xiàn)并不顯著優(yōu)于共聚焦顯微鏡。 這種儀器是*款商用顯微鏡聚焦的光，提高成像
無限分辨率：STED
僅靠光學方法顯然并沒有導致顯著改善分辨率。 有標志“表示，不只是提高百分之幾的東西，但至少雙重的或更好的一個因素。斯特凡地獄的*個概念被提出，1994年， 這個概念包括非光學物理現(xiàn)象，這是關鍵的區(qū)別較早期的嘗試。 在這里，所采用的現(xiàn)象是“受激發(fā)射”，*理論上所描述愛因斯坦，實際應用中的激光光源。 STED的概念，利用受激發(fā)射部分耗盡激發(fā)熒光發(fā)射前發(fā)生。 這對應于開關激發(fā)態(tài)的激發(fā)點擴散函數(shù)的區(qū)域中。 如果耗盡，可以只發(fā)生在受衍射限制的激發(fā)點的邊界時，剩余的發(fā)光面積小，因此提高分辨率。 幸運的是，有一個簡單的方式照亮同等的邊界一個現(xiàn)貨衍射圖案：一個環(huán)形的重點。 這種集中產(chǎn)生到的照射光束的路徑中插入一個適當?shù)南辔话濉?/span> 照明，然后通過適當?shù)臒晒饧ぐl(fā)波長為兩個方面：*，與普通的圓形“艾里焦點”，然后，在適當波長光由一個環(huán)形的“枯竭焦點”。 排放，然后收集在任何其他的掃描光學顯微鏡像。 STED顯微鏡，因此“輕松”來自激光掃描共聚焦顯微鏡。 *市售系統(tǒng)指定的分辨率下降到2007年的80納米。
另一種方法：GSD
一旦STED*分辨率已經(jīng)證明了它的能力允許，具有更好的分辨率比純光電（衍射極限）成像，咒語被打破，它是安全的討論*越衍射極限分辨率的圖像。 第二個突出的方法是隨機情形性質(zhì)。 的熒光發(fā)電機充分稀釋，以確保觀察點起源只能從單個發(fā)射器的約束條件下，可以假設該點代表的點擴展函數(shù)。 然后，它是一個簡單的任務，找到該點擴散函數(shù)，它允許以非常高的精度進行本地化的發(fā)射極的中心。 為了重建一個完整的圖像，這是需要記錄的圖像，每個只包含幾個分離的發(fā)射器 - 通往下一個連貫的圖像結(jié)構(gòu)研究的一個大序列。 在這里，一個開關，需要每幅圖像，以確保足夠稀疏的發(fā)射和沉默的發(fā)射器也恢復為后續(xù)的圖像是必要的，覆蓋整個結(jié)構(gòu)。 早期建議使用切換熒光蛋白做任務。 然而，幾乎所有的熒光染料也產(chǎn)生開關行為暗狀態(tài)和背部的興奮狀態(tài)。 *有名的暗態(tài)三重態(tài)，這是由熒光隨機假設。 適當?shù)膹姸日丈鋾r，大部分的熒光分子可以保持在一個黑暗的狀態(tài)，只是偶爾的分子處于激發(fā)狀態(tài)駐留很短的一段。 在這段時間內(nèi)，每平方尺被記錄下來，并準備隨后的*級解決本地化。 這種方法被稱為基態(tài)耗盡顯微鏡。基于這樣的理念，在2011年推出商業(yè)系統(tǒng)， 徠卡SR GSD
本地化的第三維
本地化顯微鏡提供了改進的橫向分辨率。 理論上，也可以本地化的所有點沿z軸的強度*大，但是，這將需要一個***的長采集時間。 此外，定位顯微鏡通常是基于TIRF技術，這是不聚焦到樣品上。 盡管如此，由TIRF范圍是一些為300nm，這將是感興趣的，可以在此范圍內(nèi)的位置進行測量的發(fā)射極。 為了完成這個任務，被轉(zhuǎn)向的優(yōu)勢：散光的光學像差。 透鏡往往會產(chǎn)生一個點源在沒有獲得焦點的棒狀結(jié)構(gòu)。 即使當場在焦平面上正確地重構(gòu)，人們可以檢測焦平面上方和下方的筆形的結(jié)構(gòu)。 有趣的是，這些鉛筆與z軸旋轉(zhuǎn)。 在z解決的定位顯微鏡，散光引入故意由圓柱形透鏡插入。 的旋轉(zhuǎn)角度，然后測量每個本地化點，*后給出了精確度為約50 nm的z軸。 此方法適用于任何類型的定位，因此也與上述的接地狀態(tài)耗盡技術相結(jié)合。 這樣的文書近期推出商業(yè)版本
無限的分辨率在所有尺寸：STED 3D
*終物鏡是無限的分辨率，橫向和軸向場大小和工作距離沒有限制。 STED方法提供免費聚焦到樣品 - 至少在理論上。 有限的軸向分辨率的障礙是可以克服的消耗勵磁上面的前部和后部的端部的點擴展函數(shù)的特殊相位掩模。 不幸的是，這樣的相位掩模的設計，并沒有允許在橫向方向上的零，同時進行。 ，以計算側(cè)向和軸向的同構(gòu)的點擴展函數(shù)（這在本質(zhì)上是球體），受激發(fā)射損耗的技術結(jié)合4PI技術。雖然這種方法效果很好，繁瑣4PI的只是一個不平凡的技術結(jié)合顯微鏡是沒有準備好，以作為在生物醫(yī)學實驗室的日常工具。 即使是受過良好教育的設施和訓練有素的成像會質(zhì)疑這樣的設備的*終利益。 一個更簡單的解決方案是結(jié)合橫向和軸向STED顯微鏡在3D模式。 在這里，耗盡光束首先被由一個可調(diào)諧分束裝置。 一條腿配有一個旋渦的相位掩模（這是*好的設計提高橫向分辨率）。 改善軸向分辨率，被稱為“z軸環(huán)形”，是理想的相位掩模配備另一條腿。 重組創(chuàng)建的兩腳的點擴散函數(shù)，它的形狀是一個中空的球體（想象的果凍甜甜圈）。 這個空心球體除去激發(fā)態(tài)的激發(fā)點擴散函數(shù)在所有方向上的中心周圍。 由于側(cè)向和軸向耗盡的比例是可調(diào)的，設置可以進行優(yōu)化，以實現(xiàn)無論是同構(gòu)的分辨率，*小的檢測量，或*大橫向與軸向分辨率。 該技術是現(xiàn)在市售（徠卡TCS SP8 STED 3X ）的標題畫面（左）和共聚焦顯微鏡三維受激發(fā)射損耗（右）示出了比較。 組蛋白在HeLa細胞的細胞核染色。 水平部（上半部分）中的虛線表示的位置的輪廓部分中，這是在將顯示在下部。 注意三維STED在側(cè)向和軸向兩個方向上的分辨率的顯著改善。
圖 2：STED 3X照明模塊的光路。 耗盡激光能量被分成兩個級分中，其比例是可以調(diào)整由一個可調(diào)諧的分離器（VS）。 一只胳膊包含相位掩模（φxy），是專為衍射無限的橫向分辨率。 時，另一臂配用不同的相位掩模（φZ），允許在軸向方向上的*分辨率。 這兩種照明模式相結(jié)合，在合并（M）。 由此產(chǎn)生的枯竭束在橫向和軸向方向可調(diào)分辨率的改善。