尼康顯微鏡告訴你，什么是相差顯微鏡？

相差顯微鏡，在1934年首次描述由荷蘭物理學(xué)家釉澤尼克，對(duì)比度增強(qiáng)的光學(xué)技術(shù)，可以利用以產(chǎn)生高對(duì)比度的圖像的透明標(biāo)本，如活細(xì)胞（通常在培養(yǎng)物），微生物，薄的組織切片，光刻圖案，纖維，膠乳分散體，玻璃碎片，和亞細(xì)胞顆粒（包括核和其它細(xì)胞器）。

實(shí)際上，相位對(duì)比技術(shù)采用了光學(xué)機(jī)構(gòu)翻譯成相應(yīng)的振幅的變化，它可以是可視化圖像的對(duì)比度差異的相位的微小變化。相差顯微鏡的主要優(yōu)點(diǎn)之一是沒有先前被殺害，固定，染色，活細(xì)胞中可以檢查它們的自然狀態(tài)。其結(jié)果是，可以觀察和持續(xù)的生物學(xué)過程的動(dòng)態(tài)記錄，可在高對(duì)比度的鮮明清晰分鐘標(biāo)本細(xì)節(jié)。

圖1中顯示的是一個(gè)現(xiàn)代的直立相襯顯微鏡的剖開圖，包括相位對(duì)比光學(xué)列車的示意圖。部分相干照明產(chǎn)生的鹵鎢燈被引導(dǎo)通過聚光透鏡集中在臺(tái)下聚光前焦平面定位在一個(gè)專門的環(huán)形帶（標(biāo)記為聚光鏡的環(huán)形帶）。波前通過環(huán)照亮標(biāo)本，通過不偏離或標(biāo)本中存在的結(jié)構(gòu)和相位梯度相衍射和智障。不偏離的偏析，由相差板的后側(cè)焦點(diǎn)面的衍射光由物鏡收集并聚焦在中間像平面形成的*后階段在目鏡中觀察到的對(duì)比度的圖像。

本發(fā)明的相襯技術(shù)之前，透射明場(chǎng)照明的*常用的觀察模式，在光學(xué)顯微鏡，尤其是對(duì)于固定，染色標(biāo)本或其他類型的可見光具有高的自然吸收的樣品之一。總的來說，的標(biāo)本容易地成像與明照明被稱為振幅對(duì)象（或標(biāo)本），因?yàn)檎彰鞯牟嚸娴恼穹驈?qiáng)度降低，當(dāng)光穿過試樣。

可以采用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的明視野顯微鏡相襯光學(xué)配件此外，作為一種技術(shù)來呈現(xiàn)一個(gè)讓人聯(lián)想到光學(xué)染色（參見圖2）在透明的標(biāo)本對(duì)比度增強(qiáng)效果。光波衍射和標(biāo)本（稱為相位對(duì)象）的相移可以轉(zhuǎn)化相襯中的目鏡可觀察到振幅差異。大的，擴(kuò)展的標(biāo)本也容易可視化，由于衍射和散射的現(xiàn)象，發(fā)生在這些對(duì)象的邊緣的相位對(duì)比光學(xué)系統(tǒng)。現(xiàn)代相襯顯微鏡的性能做精，使標(biāo)本中含有非常小的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，甚至只是一些蛋白質(zhì)分子，被檢測(cè)到時(shí)電子增強(qiáng)和收購后的圖像處理技術(shù)被耦合到。

圖2給出了培養(yǎng)的活細(xì)胞，在明視場(chǎng)和相襯照明成像的比較。細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中含有的氨基酸，維生素，礦物鹽，胎牛血清沐浴在單層培養(yǎng)的人膠質(zhì)腦組織。明照明（圖圖2（a）），細(xì)胞出現(xiàn)半透明只高折射區(qū)域，如膜，細(xì)胞核，而獨(dú)立的細(xì)胞（圓形或球形），可見。當(dāng)觀察相襯光學(xué)配件，同一領(lǐng)域的觀點(diǎn)揭示顯著更多的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)（圖2（b））。蜂窩附件成為可辨別的一樣，大部分的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。此外，顯著提高對(duì)比度的范圍。

澤尼克相襯光學(xué)理論的發(fā)展是一個(gè)很好的例子，如何從一個(gè)高度專業(yè)化的領(lǐng)域（在這種情況下，理論物理）的研究成果可以產(chǎn)生創(chuàng)新的新發(fā)展，在看似無關(guān)的學(xué)科，如生物學(xué)和醫(yī)學(xué)。在第二次世界大戰(zhàn)期間，在德國(guó)耶拿的蔡司光學(xué)工程是世界上*家將實(shí)際相襯光學(xué)顯微鏡。生物研究的直接影響是顯著的，和該技術(shù)的廣泛應(yīng)用，持續(xù)到目前的一天。現(xiàn)代相襯物鏡，尼康等光學(xué)制造商設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的，是能夠結(jié)合輔助對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)，如微分干涉對(duì)比，熒光，偏振光。這些物鏡是提供與內(nèi)部相位板有不同的吸收和相位位移環(huán)繞（未衍射）照明水平，產(chǎn)生廣泛的標(biāo)本對(duì)比度和背景強(qiáng)度的選擇相襯顯微鏡。

光波階段標(biāo)本的相互作用

事件眼波目前在照明光束變成分為兩部分后，通過一個(gè)階段的標(biāo)本。其主要組件是一個(gè)不偏離（非衍射的零階）的平面波前 ，通常被稱為環(huán)繞（S）波，通過和試樣周圍，但不與它進(jìn)行交互。此外，也產(chǎn)生了偏離或衍射的球面波前 （D -波），也變成分散在很寬的?。ㄔ谠S多不同的方向），通過全開光圈的物鏡。在離開試樣平面，環(huán)繞聲和衍射的光波進(jìn)入物鏡的前透鏡元件，其后集中他們通過干涉相結(jié)合，以產(chǎn)生所得的粒子波（通常簡(jiǎn)稱為P -波）在中間像平面。相襯顯微鏡中產(chǎn)生的各種光波之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，可以簡(jiǎn)單地描述為：

P = S +e

取決于檢測(cè)的標(biāo)本圖像的相對(duì)強(qiáng)度的差異，因此，在振幅上的粒子和環(huán)繞聲（P和S波）。如果粒子和環(huán)繞波的振幅顯著不同的中間像平面中，則檢體取得了相當(dāng)數(shù)量的對(duì)比，并且很容易在顯微鏡目鏡可視化。否則，將試樣保持透明和普通明場(chǎng)條件下（在相襯或其它對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)的情況下），因?yàn)樗鼤?huì)出現(xiàn)。

在檢體及其周圍介質(zhì)中，該部分的入射光的波前穿過檢體（D -波），但不通過周圍介質(zhì)（S -波）之間的光路變化，略有滯后。對(duì)于在相襯顯微鏡的參數(shù)，改變波通過的光路長(zhǎng)度（實(shí)際上，相對(duì)相移）中的試樣的作用是非常重要的。在經(jīng)典光學(xué)系統(tǒng)中，通過一個(gè)物體或空間的光路長(zhǎng)度（OPL）的折射率（n）的和的厚度（噸）的對(duì)象或中間介質(zhì)中所描述的這種關(guān)系的商品

光學(xué)路徑長(zhǎng)度（OPL）= N×T

當(dāng)光從一種介質(zhì)傳遞速度被改變成另一種，兩種介質(zhì)的折射率之間的差異成比例。因此，當(dāng)相干光器發(fā)出的電磁波聚焦鏡燈絲通過檢體具有特定的厚度（t）的折射率（n）的相位，波可以是增加或減少速度。如果試樣的折射率大于周圍介質(zhì)，波速度降低，而通過試樣，隨后在相對(duì) 的相位滯后時(shí)，從檢體出現(xiàn)。相反，當(dāng)周圍介質(zhì)的折射率*過試樣，波*的退出時(shí)試樣的相。的緊急檢體和周圍介質(zhì)中的波陣面之間的位置的差異被稱為相移（δ），并以弧度為單位定義為：

δ=2πΔ/λ

在上述方程中的術(shù)語D，這是類似的光路長(zhǎng)度的光程差被稱為：

光程差（OPD）=Δ=（₂ - N ₁）×T

其中，N（2）是（1）試樣的折射率和?是周圍介質(zhì)的折射率。的光程差的查詢結(jié)果從兩個(gè)術(shù)語的商品：試樣的厚度，其與周圍介質(zhì)的折射率的差異。在許多情況下的光程差可以是相當(dāng)大的，即使試樣的厚度是小的。另一方面，當(dāng)試樣的折射率等于周圍介質(zhì)中，光路差為零時(shí)，無論是否用試樣的厚度是大還是小。

對(duì)于各自的細(xì)胞在組織培養(yǎng)中，光程差也比較小。一個(gè)典型的單層培養(yǎng)的細(xì)胞具有約5微米的厚度和折射率約1.36。該信元被包圍的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，其折射率為1.335，0.125微米，或約四分之一波長(zhǎng)（綠色光）產(chǎn)生的光程差。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生小得多遲鈍的。這些小光程差產(chǎn)生的線性強(qiáng)度降低，增加移相（圖像的增長(zhǎng)逐漸變暗）到一個(gè)點(diǎn)（取決于相位板配置），在這之后，通過對(duì)比逆轉(zhuǎn)標(biāo)本圖像變得更亮。在相襯顯微鏡的圖像的強(qiáng)度不承擔(dān)試樣的整個(gè)厚度和折射率范圍的光程差所產(chǎn)生的一個(gè)簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。相反，強(qiáng)度依賴于多種因素，包括吸收的相位板，相位*前或相差的相位板的程度，相對(duì)此相移的跡象。

波相互作用相差顯微鏡

在圖3中，環(huán)繞，衍射和顆粒（S，D，和P）的試樣，該區(qū)域在明視野顯微鏡（相襯光學(xué)配件的情況下）的圖像平面的波之間的相位關(guān)系。環(huán)繞波和粒子，其相對(duì)幅度的數(shù)額確定標(biāo)本的對(duì)比，紅線和綠線（分別）所示。從檢體，這是從來沒有直接觀察到的，由X射線衍射產(chǎn)生的波被描繪成一個(gè)藍(lán)色的波振幅較低。環(huán)繞聲波和衍射波通過干擾復(fù)合生成的顯微鏡圖像平面中的所得到的粒子波。圖3中所示的每個(gè)波的振幅表示波的各個(gè)組件的電矢量的總和。

相對(duì)于環(huán)繞波，衍射波振幅較低（因?yàn)橛懈俚难苌浔拳h(huán)繞聲光子的圖像點(diǎn)），通過與試樣相互作用約90度（四分之一波長(zhǎng)）在相位上被延遲。的二十分之一波長(zhǎng)表現(xiàn)出輕微的相移，通常在細(xì)胞中觀察到的微小的細(xì)節(jié)，所得到的粒子波（而產(chǎn)生的衍射波和環(huán)繞聲之間的干擾），以及相關(guān)的光路長(zhǎng)度差。由于環(huán)繞和粒子波的振幅幾乎是一樣的，透明的標(biāo)本完全缺乏對(duì)比和疊加對(duì)明亮的背景時(shí)，幾乎是無形的。

單個(gè)波陣面之間的關(guān)系，在明視場(chǎng)和相襯顯微鏡可以使用極坐標(biāo)系統(tǒng)的矢量描述。在該系統(tǒng)中，矢量的長(zhǎng)度表示一個(gè)特定的波的振幅，而相對(duì)于一個(gè)固定的參考（角的相移）的旋轉(zhuǎn)矢量表示的角度的相位位移的程度（參見圖3（b））。波相互作用相襯顯微鏡引入向量表示由澤尼克弗里茨，后來又發(fā)展了詳細(xì)的羅伯特更加光禿。雖然這種描述的援助很少利用的今天，許多文本和研究報(bào)告發(fā)表在過去幾年依靠向量圖說明了波關(guān)系的討論。

在相襯向量圖，說明相位延遲順時(shí)針旋轉(zhuǎn)（參考任意方位），而被描述為逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)相位進(jìn)步。環(huán)繞（S）和衍射的矢量和在圖3（b），這在技術(shù)上是一個(gè)相量圖，（D）的波陣面產(chǎn)生所得到的顆粒（P）的波陣面。這種機(jī)制是方便，因?yàn)樗兄谘苌洳ǖ南嘁?，以及它們是如何影響的階段，由此產(chǎn)生的粒子波（反之亦然）的可視化呈現(xiàn)波關(guān)系。在圖3（b）在圖形上的環(huán)繞波的衍射波的相對(duì)相移為Φ，其中：

Φ=±90°+φ/ 2

在該等式中，φ為環(huán)繞（S）和粒子（P）的波矢之間的相對(duì)相移（光程差的函數(shù)）。顯示可以忽略不計(jì)的光程差（實(shí)際上，無相移）的標(biāo)本，后者中的u為零和Φ變成±90度。中提出的圖3（b）所示，衍射（D）波具有非常低的幅度小的（或不存在）中的粒子幾乎等于環(huán)繞波的振幅波的相移的結(jié)果。環(huán)繞波和粒子時(shí)也有類似的振幅（或強(qiáng)度），有沒有代對(duì)比，在明亮的背景和試樣仍然無形。

相差顯微鏡

相差顯微鏡的設(shè)計(jì)的*重要的基本概念是從檢體，這是投射到不同的位置的物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面（上面的物鏡后孔的衍射平面）出現(xiàn)的偏析的環(huán)繞和衍射波陣面。此外，必須減少環(huán)繞（不偏離）光的振幅和相位*前或滯后（四 分之一波長(zhǎng)），以*大限度地提高圖像平面中的檢體和背景之間的強(qiáng)度差異。用于產(chǎn)生相對(duì)相位延遲的機(jī)制是一個(gè)兩步驟的過程中，試樣由四分之一波長(zhǎng)的相位滯后與衍射波，而環(huán)繞波的前進(jìn)（或滯后）在相位上的相位板位于或非?？拷镧R后焦平面。只有兩個(gè)專門的配件都需要轉(zhuǎn)換一個(gè)明場(chǎng)顯微鏡相襯觀察。一個(gè)特別設(shè)計(jì)的環(huán)形光闌的直徑相匹配，這是光學(xué)共軛的內(nèi)部的居住在物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面的相位板，被放置在聚光鏡的前焦面。

聚光鏡的環(huán)形帶（圖1和圖4中示出）通常是透明的圓環(huán)，這是位于前焦平面（光圈）的聚光鏡構(gòu)成為平坦的黑色不透明的（光吸收）的板材，使試樣能離焦，從環(huán)發(fā)出的平行光的波陣面被照亮。在顯微鏡聚光鏡圖像在無窮遠(yuǎn)處的環(huán)形隔膜，而物鏡上面的后側(cè)焦點(diǎn)面（其中的共軛的相位板的定位，如下面所討論）產(chǎn)生一個(gè)圖像。應(yīng)當(dāng)指出，多文本描述了從聚光鏡的相襯顯微鏡的光錐與黑暗的中心為中空的應(yīng)急照明。這個(gè)概念是用于描述配置，但不是嚴(yán)格精確。聚光鏡的環(huán)形帶替換，或位于靠近聚光鏡的前孔中的調(diào)節(jié)可變光闌。當(dāng)進(jìn)行相位對(duì)比實(shí)驗(yàn)，利用相位環(huán)空和孔徑光闌中的聚光鏡，檢查，以確?？勺児怅@的開度較大比的相位環(huán)形帶的外周的。相襯照明和檢測(cè)圓形的幾何與微分干涉對(duì)比和霍夫曼調(diào)制對(duì)比度，使標(biāo)本的觀察，沒有方向相關(guān)文物。相襯也是偏振和雙折射效應(yīng)不敏感，這是一個(gè)重大的優(yōu)勢(shì)時(shí)，研究活細(xì)胞生長(zhǎng)在塑料組織培養(yǎng)容器。

科勒照明的條件下，環(huán)繞聲，不與試樣集中的物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面（衍射面），為亮環(huán)的光波。在這些條件下，物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面是共軛到聚光鏡的前面開口面，所以非衍射的零階光波形成聚光鏡的環(huán)形帶的明亮影像的物鏡（在圖像上疊加的后孔相位板）。通過的球面波前 的試驗(yàn)片（的D波）衍射的衍射平面的不同位置，在整個(gè)物鏡后孔。衍射光的分布（數(shù)量和位置）的數(shù)目，大小，和折射率差的試樣的光散射中的對(duì)象。對(duì)于大多數(shù)樣品中，只有一小部分的入射光波被衍射，一個(gè)大部分光穿過不偏離*終照亮整個(gè)圖像平面。

與此相反，環(huán)繞平面波陣面中占有的比例較小的物鏡后的光圈值，這對(duì)應(yīng)于聚光鏡的環(huán)形帶的共軛。因此，這兩個(gè)波陣面不重疊到一個(gè)顯著的程度，并占據(jù)物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面上的不同的部分。因?yàn)橹苯拥牧汶A光，衍射光的衍射平面中空間上分開的，兩種波分量的相位（環(huán)繞聲，S或衍射，e）可以有選擇地操縱，而不與其他干擾。

甲相位板被安裝的物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面或其附近的（請(qǐng)參閱圖4和5），以便選擇性地改變的相位和振幅的環(huán)繞（或不偏離）的標(biāo)本的光通過。在某些相襯物鏡，薄相位板包含一個(gè)減小的厚度，以環(huán)繞（S）由四分之一波長(zhǎng)的波的相差異推進(jìn)玻璃蝕刻成環(huán)。通常情況下，該環(huán)也涂有金屬膜的局部吸收60-90％，以減少環(huán)繞光振幅。由于后側(cè)焦點(diǎn)面附近的內(nèi)部透鏡元件，通常位于一些相襯物鏡產(chǎn)生的實(shí)際蝕刻成的透鏡的表面。無論物鏡是如何制造的，*重要的一點(diǎn)要記住的是，每一個(gè)相襯物鏡相板，一個(gè)特點(diǎn)，就是沒有從所有其他顯微鏡物鏡被修改為包括。

到達(dá)圖像平面的波陣面之間的干擾，因?yàn)樗玫降牧Ｗ硬óa(chǎn)生完全由的環(huán)繞和衍射波陣面的干擾，產(chǎn)生的顆粒（P）波具有現(xiàn)在的振幅大大小于環(huán)繞時(shí)，中性密度施加涂層。凈效果是變換將樣品注入引入的振幅（強(qiáng)度）出射的光從圖像平面的差異的相對(duì)相差。因?yàn)槿搜劢忉屆芏炔町?，如?duì)比度，試樣在顯微鏡目鏡中可見，在膠片上與傳統(tǒng)的攝像系統(tǒng)，或數(shù)字，利用CCD或CMOS的移動(dòng)設(shè)備也可以被捕獲。所有正相襯系統(tǒng)選擇性地推進(jìn)線性環(huán)繞（S）的相位波前的球面衍射（D）波前相。另外，負(fù)相襯阻礙環(huán)繞相對(duì)于試樣衍射光波的波陣面。

在一般情況下，試樣具有更高的折射率比周圍介質(zhì)的中性灰色的背景上出現(xiàn)暗的，而那些具有比泳介質(zhì)的折射率低的試樣比灰色的背景看起來更亮。然而，這并不是總是如此，因?yàn)閷ｉT相襯物鏡，具有較高的耦合，以較低的延遲值（八分之一波長(zhǎng)或更小）的中性密度可以制作較厚的標(biāo)本對(duì)比度反轉(zhuǎn)。*終的結(jié)果是，具有很高的光程差的地區(qū)開始出現(xiàn)明亮。

為了修改的空間上分離的環(huán)繞聲和衍射相位對(duì)比光學(xué)系統(tǒng)的波陣面的相位和振幅，相位板配置了一些已被引入。由于相板位于或非常接近的物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面（衍射面）通過顯微鏡的所有光通過該組件必須穿過。聚焦聚光鏡的環(huán)形帶的相位板的部分被稱為共軛區(qū)域，而其余區(qū)域被統(tǒng)稱為互補(bǔ)區(qū)域。的共軛區(qū)域包含的材料負(fù)責(zé)改變環(huán)繞（未衍射）光無論是加或減90度的衍射波前的相位。在一般情況下，相板共軛區(qū)域?qū)挶染酃忡R的環(huán)形帶的圖像，以盡量減少環(huán)繞光的量，進(jìn)入的互補(bǔ)區(qū)域擴(kuò)大的區(qū)域中（約25％）。

一個(gè)典型的系列相襯物鏡，有越來越多的放大倍率，及其相應(yīng)的聚光鏡年輪，如圖5所示。作為一般規(guī)則，當(dāng)物鏡的數(shù)值孔徑，倍率增大時(shí)的相位板的寬度和直徑都下降。與此相反，聚光鏡的環(huán)尺寸的增大物鏡放大倍率。此外，圖5中所示剖切表示正和負(fù)的相位板的施工背后的基本概念。正相位板產(chǎn)生暗的對(duì)比度而包含部分吸收膜的設(shè)計(jì)，以減少環(huán)繞波陣面的振幅。此外，該板包含設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)向90度（延緩）的衍射光的相位相阻燃材料。負(fù)相位板還包含兩個(gè)相阻燃，部分吸收材料。然而，在這種情況下，兩種材料被夾內(nèi)未衍射環(huán)繞的波前的相位板，使影響（衰減和相位滯后90度）是*的物種。

從現(xiàn)代顯微鏡制造商提供的相差板是通過真空沉積在玻璃板上或直接到一個(gè)顯微鏡物鏡的透鏡內(nèi)表面的薄的介電和金屬膜。電介質(zhì)薄膜中的作用是把光的相位，而金屬膜未衍射的光強(qiáng)度衰減。一些制造商利用多個(gè)抗反射涂層與薄膜結(jié)合，以減少眩光量和光學(xué)系統(tǒng)的雜散光反射回。如果相位板的透鏡的表面上未形成的，它通常是凝成位于附近的物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面之間的連續(xù)鏡頭。的厚度和折射率的電介質(zhì)，金屬，和防反射膜以及水泥的光學(xué)，仔細(xì)選擇，以產(chǎn)生所需的相移的相位板之間的互補(bǔ)性和共軛的區(qū)域。在光學(xué)術(shù)語，改變環(huán)繞的光的相位相對(duì)于衍射光的相位板90度（或正或負(fù)）被稱為四分之一波長(zhǎng)板，因?yàn)樗鼈兊墓獬滩畹挠绊憽?/span>

對(duì)比度是通過改變相位板的屬性，包括金屬膜（防反射涂層），相阻燃材料的折射率，和的相位板的厚度的吸收調(diào)制。幾個(gè)顯微鏡制造商提供的各種相襯物鏡有進(jìn)步程度的對(duì)比。例如，尼康陣容包括五種類型的相襯物鏡。DL（暗低）系列物鏡一個(gè)淺灰色的背景上產(chǎn)生暗的圖像輪廓。這些物鏡是設(shè)計(jì)，提交陽性對(duì)照標(biāo)本折射率從周圍介質(zhì)中，例如組織培養(yǎng)細(xì)胞具有顯著差異。對(duì)比版本略低的物鏡，的DLL（暗低），產(chǎn)生更好的圖像明照明做的DL物鏡相比，被用作一個(gè)普遍的物鏡進(jìn)行聯(lián)合觀測(cè)熒光，明，暗場(chǎng)，微分干涉對(duì)比。

尼康也產(chǎn)生包含一個(gè)輔助的中性密度環(huán)，設(shè)計(jì)，減少暈工件，任一側(cè)上的中心相環(huán)的切趾相襯物鏡。標(biāo)本具有非常小的相差是尼康的DM（中暗）正相襯物鏡，一個(gè)中型的灰色背景上產(chǎn)生一個(gè)黑暗的圖像輪廓成像的理想人選。對(duì)于負(fù)相位對(duì)比，尼康提供的BM（明亮的中等）的物鏡，這是特別適合于視覺檢驗(yàn)，細(xì)菌鞭毛，原生動(dòng)物，血纖維蛋白纖維，分鐘球，和血細(xì)胞。明亮的介質(zhì)相襯物鏡上產(chǎn)生明亮的圖像中灰色背景。

在大多數(shù)情況下，僅僅推進(jìn)單獨(dú)環(huán)繞的波前的相對(duì)相位是不足以導(dǎo)致在顯微鏡的產(chǎn)生高對(duì)比度的圖像。會(huì)出現(xiàn)這種情況，因?yàn)榄h(huán)繞波的振幅顯著大于衍射波，并抑制所產(chǎn)生的圖像創(chuàng)建的干擾，只有一小部分的總的波數(shù)。通過應(yīng)用一個(gè)半透明金屬（中性，不透明度增加，以減少環(huán)繞的波陣面的振幅值接近（和執(zhí)行在圖像平面上的干擾）的衍射波，在物鏡的相位板密度）涂層。環(huán)繞光波，通過在相襯顯微鏡的設(shè)計(jì)幾乎完全通過相差板，在幅度上顯著地降低到一個(gè)值，該值取值范圍的原始強(qiáng)度的10％和30％之間的不透明的相位板。

在圖6中的相位板的配置，波的關(guān)系，圖和矢量圖的生成相關(guān)聯(lián)的正面和負(fù)面的相襯圖像。此外，也說明了這些技術(shù)的標(biāo)本成像的例子。正如前面所討論的，剛剛從試樣平面的衍射光的球面波前 平面環(huán)繞（未衍射）的波陣面的相位相對(duì)于四分之一波長(zhǎng)延遲。在正相位對(duì)比光學(xué)配置（在圖6中的上排圖像），環(huán)繞聲（S）的波陣面的相位*前遍歷的相位板產(chǎn)生的凈相移180度（半個(gè)波長(zhǎng)時(shí)，由四分之一波長(zhǎng)）。*的環(huán)繞的波陣面是現(xiàn)在能夠參與在與上面的中間圖像平面的衍射波（D）相消干涉。

正相襯的概述在圖6的上部。正相襯板（圖6的左手側(cè)）推進(jìn)環(huán)繞波的玻璃板中，減少了由波的物理路徑，通過在高折射率板的蝕刻環(huán)由于四分之一波長(zhǎng)。由于試樣射線衍射（e波）延遲四分之一波長(zhǎng)與試樣進(jìn)行交互時(shí)，環(huán)繞波和衍射波的相位板出現(xiàn)時(shí)之間的光程差是半波長(zhǎng)。*終的結(jié)果是一個(gè)180度的環(huán)繞波和衍射波，從而導(dǎo)致破壞性的干擾，在圖像平面上的高折射率試樣之間的光程差。正相襯的破壞性干擾波的振幅譜中描繪了圖6中上部的曲線中。所得到的顆粒（P）的振幅波低于環(huán)繞（S）波，使對(duì)象出現(xiàn)的相對(duì)比背景暗的，在*右邊（POS）的的圖像Zygnema綠藻所示。示出的矢量圖提高環(huán)繞聲波的四分之一波長(zhǎng)，這是作為一個(gè)90度逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)在正相位對(duì)比所示，該圖并在圖6中的圖像之間的顯示。

它也有可能產(chǎn)生負(fù)相襯顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，在圖6的下部所示。在這種情況下，環(huán)繞聲（S）波延遲（而不是作為*的）由四分之一波長(zhǎng)相的衍射波（D）。其結(jié)果是，具有高折射率的標(biāo)本對(duì)較暗的灰色背景顯得明亮（查看該圖像標(biāo)記在圖6的下部，NEG）。在負(fù)相位對(duì)比，物鏡相位板包含提升的環(huán)環(huán)繞波的四分之一波長(zhǎng)相對(duì)的衍射波的相位延遲的相位的零級(jí)（而不是正相襯提前相位）。由于衍射波已經(jīng)被延遲四分之一波長(zhǎng)時(shí)，通過試樣，環(huán)繞波和衍射波之間的光程差被消除，并且在圖像平面上的高折射率試樣發(fā)生相長(zhǎng)干涉。請(qǐng)注意，生成的顆粒（P）波的幅度高于負(fù)相襯環(huán)繞（S）波（參見圖6中的下面的圖）。圖中還示出的向量圖，為負(fù)相位對(duì)比，，環(huán)繞波矢經(jīng)過一個(gè)90度的順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)。

重要的是要注意，上面的物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面所形成的衍射圖案偏離和相襯和所有其他形式的光學(xué)顯微鏡中的試樣散射的所有空間頻率的傅里葉變換。因此，在中間像平面和通過目鏡觀察到*終的圖像（或記錄，可通過檢測(cè)器）產(chǎn)生的圖像表示傅立葉逆變換的衍射圖案形成在物鏡后側(cè)焦點(diǎn)面和眼點(diǎn)（浮在上面的目鏡前鏡頭）。相襯顯微鏡利用這些光學(xué)共軛性質(zhì)的增強(qiáng)圖像的對(duì)比度，通過修改顯微鏡的光圈功能引入的特定圖像信息的空間過濾。介紹的相位板（過濾器）的物鏡后部衍射平面使試樣的相位變化轉(zhuǎn)換為強(qiáng)度變化，可以觀察到在*終圖像中。

解讀相位對(duì)比圖像

用相差顯微鏡產(chǎn)生的圖像是比較簡(jiǎn)單的解釋，當(dāng)試樣很薄，并且均勻地分布在基片上（作為單層組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)的活細(xì)胞中的情況下）。檢查使用正相的光學(xué)對(duì)比度，這是傳統(tǒng)的形式，大多數(shù)制造商所生產(chǎn)的薄樣品時(shí)，它們會(huì)出現(xiàn)暗于周圍介質(zhì)中，當(dāng)試樣的折射率*過介質(zhì)。差分相位對(duì)比光學(xué)邊緣附近的周邊擴(kuò)展的標(biāo)本，如蜂窩之間的邊界膜和洗澡的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，增強(qiáng)對(duì)比度和產(chǎn)生整體高對(duì)比度的圖像，可以粗略地解釋為密度圖。因?yàn)橄嘁r的標(biāo)本圖像的振幅和強(qiáng)度相關(guān)的折射率和光路長(zhǎng)度，圖象密度可利用作為衡量各種結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行近似。效果，具有密度增加了一系列的內(nèi)部細(xì)胞器，如空泡，間期細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核（或有絲分裂的染色體），通常是可視化逐漸變暗相對(duì)于一個(gè)固定的參考對(duì)象，如背景。還應(yīng)當(dāng)指出的是，眾多的光學(xué)構(gòu)件是存在于所有的相襯圖像，大擴(kuò)展標(biāo)本往往會(huì)出現(xiàn)顯著的波動(dòng)，在對(duì)比度和圖像強(qiáng)度。對(duì)稱也可以決定如何大型和小型的標(biāo)本出現(xiàn)在相襯顯微鏡的一個(gè)重要因素。

理智的解釋相襯圖像需要仔細(xì)推敲和檢查，以確保工件不錯(cuò)誤地分配到重要的結(jié)構(gòu)特征。例如，內(nèi)部的一些細(xì)胞器和組件通常具有較低的折射率比周圍的細(xì)胞質(zhì)中，而另一些具有較高的折射率。因?yàn)檫@些眾多的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的折射率，內(nèi)部的活細(xì)胞，在積極相襯顯微鏡觀看時(shí)，可以揭示一個(gè)數(shù)組的強(qiáng)度，范圍從非常明亮的極暗。例如，吞飲小泡，脂滴，和空中液泡存在于植物和單細(xì)胞原生動(dòng)物比細(xì)胞質(zhì)具有低的折射率，因此顯得比其他元件更明亮。相反，如上面所討論的，具有高折射率的細(xì)胞器（細(xì)胞核，核糖體，線粒體，核仁）出現(xiàn)在顯微鏡暗。如果試樣引入的相位延遲足夠大（約半波長(zhǎng)的衍射波的相移）的衍射波和環(huán)繞波之間的干擾變得建設(shè)性的，使這些標(biāo)本的亮度比周圍的背景。

為了避免混亂，相襯圖像的亮區(qū)和暗的對(duì)比，光程差內(nèi)發(fā)生的試樣制備應(yīng)慎重考慮。如上所討論的，光程差是來自于商品的折射率和檢體（對(duì)象）的厚度，和相關(guān)的檢體之間的相對(duì)相移和背景（衍射和環(huán)繞）波。這是不可能區(qū)分高，低折射率部件，沒有相關(guān)的信息的組件的相對(duì)厚度在相襯圖像。例如，一個(gè)小的檢體具有高的折射率，可以顯示更大范圍內(nèi)的試樣具有較低的折射率相同的光學(xué)路徑差。的兩個(gè)試件，將具有大致相同的強(qiáng)度時(shí)，通過相位對(duì)比光學(xué)系統(tǒng)。在許多生物實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生收縮或膨脹的細(xì)胞或細(xì)胞器的條件，可能會(huì)導(dǎo)致顯著的對(duì)比度變化。外部介質(zhì)也可以被替換為另一個(gè)具有較高或較低的折射率，在試樣圖像的對(duì)比度的變化來產(chǎn)生。事實(shí)上，在周圍介質(zhì)的折射率變化形成的圖像的對(duì)比度的效果的基礎(chǔ)上的技術(shù)被稱為浸沒折光率。

圖7中幾個(gè)半透明的標(biāo)本有正面和負(fù)面的階段對(duì)比度光學(xué)系統(tǒng)成像。圖7（a）和7（b）示出一個(gè)櫛魚鱗，在正相位對(duì)比（圖7（a））和負(fù)相位對(duì)比（圖7的（b）），在相對(duì) 較高的倍率（200倍）。這些尺度通常發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)的硬骨魚類（簡(jiǎn)稱為硬骨魚類）。前（或前面）的一部分，每一個(gè)規(guī)模通常藏后面的后部，前述的規(guī)模。隨著魚的生長(zhǎng)，這樣做的尺度，導(dǎo)致圖案的同心生長(zhǎng)“環(huán)”規(guī)模大小的數(shù)量增加，出現(xiàn)類似樹干的橫截面中發(fā)現(xiàn)的那些。在某些情況下，櫛鱗生長(zhǎng)型態(tài)用于判斷魚的年齡。年輪出現(xiàn)黑暗包圍的淺灰色暈地區(qū)正相襯（圖7（a）），但呈現(xiàn)輕得多，四周暗槽與負(fù)相襯（圖7（b））。

甲文化活的中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞在明照明模式下顯示為透明的時(shí)沐浴在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，細(xì)胞的折射率，這是非常接近的營(yíng)養(yǎng)鹽緩沖液。正相襯（圖7（C）），細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)節(jié)，包括細(xì)胞核和細(xì)胞器，可以很容易地可視化。然而，當(dāng)負(fù)相襯照明下檢查，細(xì)胞輪廓變得難以分辨，內(nèi)部細(xì)節(jié)很大程度上掩蓋除高折射率變得非常明亮的細(xì)胞器（圖7（D））。*后，人類紅細(xì)胞出現(xiàn)暗灰色的扁橢球一個(gè)的甜甜圈輪廓和明亮的中心正相襯（圖7（E）），但相同的細(xì)胞是光明與黑暗的中心（圖7（f）條），并脫穎而出大幅在負(fù)相襯的背景。

兩個(gè)非常常見的效果相襯圖像的特征暈和關(guān)閉陰影對(duì)比度型態(tài)中，所觀察到的強(qiáng)度不直接對(duì)應(yīng)于檢體和周圍介質(zhì)之間的光程差（折射率和厚度值）。雖然這些模式的出現(xiàn)的相位對(duì)比光學(xué)系統(tǒng)的自然結(jié)果，它們通常被稱為相位工件或圖像失真。在各種形式的正相襯，明亮的階段暈通常環(huán)繞大型標(biāo)本的功能和媒體之間的界限。出現(xiàn)相同的光暈比負(fù)相襯光學(xué)系統(tǒng)試樣的暗。這些效果是由光程差的波動(dòng)，可以把黑暗中明亮的光暈正相襯，負(fù)相襯亮暗暈進(jìn)一步加劇。

暈圈出現(xiàn)在相襯顯微鏡，因?yàn)閳A形的相阻燃（中性密度）環(huán)位于在物鏡相位板也從試樣的衍射光（它并非只限于單獨(dú)通過環(huán)繞波）發(fā)送一個(gè)小的程度。的事實(shí)，使問題更為復(fù)雜的零級(jí)的環(huán)繞波陣面的相位板投射到聚光鏡的環(huán)形帶的寬度小于相板環(huán)的實(shí)際寬度。的差異的相位板環(huán)和環(huán)繞的波陣面之間的寬度通常是大約25％到40％，但是必要的，由于光學(xué)設(shè)計(jì)上的限制和要求的。由于在物鏡的衍射面，只有那些對(duì)應(yīng)的低空間頻率衍射的相位板的環(huán)形試樣通過的波陣面的相位改變環(huán)的圓形的空間位置。因此，衍射標(biāo)本的波通過相板保持90度（四分之一波長(zhǎng)）的零階（不偏離或環(huán)繞）光相。由此產(chǎn)生的相襯鹵代工件由于衍射試樣通過一個(gè)非常淺的角度相對(duì)于環(huán)繞的零級(jí)波前的低空間頻率信息的衰減。實(shí)際上，低空間頻率的波陣面的衍射試樣之間的破壞性干涉的情況下不偏離的光波產(chǎn)生一個(gè)試樣周圍的局部對(duì)比度反轉(zhuǎn)（表現(xiàn)由鹵素）。為了創(chuàng)建一個(gè)鋒利的邊緣圖像中，所有的空間頻率衍射試樣必須在*終圖像中表示。

相襯光環(huán)圍繞著一個(gè)大型，低空間頻率的物體，如細(xì)胞核，硅藻，整個(gè)細(xì)胞中表現(xiàn)得尤為突出和明顯的。鹵代工件的另一個(gè)因素是在圖像平面上的光能量的再分配，從區(qū)域是破壞性的區(qū)域建設(shè)性。大的，高對(duì)比度的光暈產(chǎn)生混亂的圖像產(chǎn)生大的光程差，如紅細(xì)胞，霉菌，酵母，原生動(dòng)物細(xì)胞，細(xì)菌的樣品。另一方面，鹵素效果往往可以強(qiáng)調(diào)對(duì)比度的差異的試樣和其周圍的背景，并可以增加薄的邊的可見性和邊界的細(xì)節(jié)在許多標(biāo)本。這種效果是特別有用的在負(fù)的相位相反，其產(chǎn)生的暗暈周圍的低頻圖像的細(xì)節(jié)。在許多情況下，能夠減少相移的程度和衍射，從而減少暈圈的大小試樣周圍。用于除去或衰減強(qiáng)度的暈的*簡(jiǎn)單的補(bǔ)救辦法是修改的觀察介質(zhì)的折射率具有更高折射率的組件，如甘油，甘露糖醇，葡聚糖，或血清白蛋白。在某些情況下，改變折射率的介質(zhì)，甚至可以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)圖像對(duì)比度，轉(zhuǎn)向暗標(biāo)本的功能亮點(diǎn)不顯著令人不安的背景強(qiáng)度。

光環(huán)效應(yīng)，也可以顯著降低，利用專門設(shè)計(jì)的階段物鏡，包含中性密度材料圍繞中央相環(huán)材料的物鏡后孔附近的一個(gè)小環(huán)。這些物鏡被稱為切趾相襯物鏡，使結(jié)構(gòu)的階段具有很大的相差異，具有出色的清晰度和細(xì)節(jié)的定義來看待和拍攝對(duì)象。在大多數(shù)情況下，可以清楚地分辨細(xì)胞內(nèi)的功能（如核仁）具有明暗反差變跡的物鏡，但這些相同的功能，有明亮的光暈或?yàn)榱咙c(diǎn)，使用傳統(tǒng)的光學(xué)相襯成像。與變跡的光學(xué)系統(tǒng)，對(duì)比度是相反的，由于相對(duì)于試樣的直接光通過的大振幅的繞射光。

在實(shí)踐中，鹵代減少和增加與變跡光學(xué)系統(tǒng)的標(biāo)本的對(duì)比，可以實(shí)現(xiàn)通過利用選擇性振幅相鄰建立到物鏡的相位板上面的后側(cè)焦點(diǎn)面上的相位膜的過濾器。這些振幅濾波器包括中性密度施加到周圍的相位膜的相位板的薄膜。在經(jīng)典的相位板的透射率的相移環(huán)是約25％，而對(duì)周圍的相鄰環(huán)的相移圈中的切趾板有50％的透射率的中性密度。在這兩個(gè)板的相位膜的寬度是相同的。這些值是一致的相移的透射率值的薄膜適用于標(biāo)準(zhǔn)板在相襯顯微鏡。

關(guān)閉陰影相襯顯微鏡的光學(xué)神器是另一種非常常見的，往往是*容易觀察到大型，擴(kuò)展階段標(biāo)本。它通常會(huì)被預(yù)期會(huì)出現(xiàn)一個(gè)大的形象相試樣具有恒定的光路長(zhǎng)度橫跨直徑均勻或深或淺，在顯微鏡。不幸的是，用相襯顯微鏡所產(chǎn)生的圖像的強(qiáng)度并不總是承受一個(gè)簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，由試樣產(chǎn)生的光程差。其他因素，如吸收的相位板和相位延遲或提高量，以及相對(duì)的相位板和聚光鏡的環(huán)形帶的重疊大小也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。大，厚度均勻的正位相對(duì)比試樣的強(qiáng)度分布往往從邊緣逐漸增加光的強(qiáng)度在中部地區(qū)的中心，在那里可以接近周圍介質(zhì)（相反的是真正的負(fù)相標(biāo)本）。這種效應(yīng)被稱為陰影關(guān)閉，并經(jīng)常觀察研究擴(kuò)展平面的標(biāo)本，如材料板材（玻璃或云母），副本，扁平的組織培養(yǎng)細(xì)胞和大細(xì)胞器時(shí)。

正面和負(fù)面的相襯的鹵素和濃淡銷工件的影響列于圖8為一個(gè)假設(shè)的擴(kuò)展的相位檢體具有矩形幾何形狀和較高的折射率比周圍介質(zhì)中（圖8（a））。記錄整個(gè)試樣的中央?yún)^(qū)域上的光強(qiáng)分布圖8（b）中示出。正相襯（圖8（C）），標(biāo)本圖像呈現(xiàn)出**的耀眼光環(huán)，并演示了一個(gè)戲劇性的樹蔭效果，這是遍歷時(shí)表現(xiàn)逐步增加強(qiáng)度試樣從邊緣到中部地區(qū)（見強(qiáng)度分布在圖8（d）段）。的光環(huán)和陰影關(guān)閉效果已經(jīng)扭轉(zhuǎn)負(fù)相襯（圖8（e）及8（f）條）的強(qiáng)度。一個(gè)黑暗的光環(huán)圍繞著標(biāo)本圖像查看時(shí)負(fù)相襯光學(xué)（圖8（E）），和樹蔭過渡范圍從明亮邊緣的中心暗灰色的水平。此外，在強(qiáng)度分布圖（圖8（f）條）是相反的，從與正相位對(duì)比觀察。

樹蔭下脫落的現(xiàn)象也通常被稱為區(qū)域行動(dòng)的效果，在試樣厚度均勻，因?yàn)橹醒雲(yún)^(qū)衍射光不同于高折射率區(qū)邊緣和界限。在中央?yún)^(qū)域的一個(gè)標(biāo)本的相對(duì)角度和衍射光的量顯著減少時(shí)相比，邊緣。源于中央的試樣區(qū)域的衍射波陣面，因?yàn)橹挥休p微的空間偏離的零級(jí)非偏離的的環(huán)繞波陣面（但仍然是由四分之一波長(zhǎng)的相位滯后），它們被捕獲的物鏡后方的相位板焦平面，以及與環(huán)繞光。其結(jié)果是，試樣的中心區(qū)域的強(qiáng)度基本上保持相同的背景。外觀遮蔭的影響在相對(duì) 平坦的標(biāo)本地區(qū)，邊緣和界限產(chǎn)生過高的對(duì)比度，提供了強(qiáng)有力的證據(jù)表明相襯機(jī)制主要是受合并衍射和散射現(xiàn)象。

光環(huán)和陰影銷文物依賴于幾何和光學(xué)特性的相板和被檢查的標(biāo)本。的寬度和相位板的透射率的材料特別是，在控制這些效果（相差板的寬度通常是十分之一左右的總開口面積的物鏡）發(fā)揮了關(guān)鍵作用。更廣泛的相位板具有降低透光率，往往會(huì)產(chǎn)生較高的強(qiáng)度光暈和樹蔭，而環(huán)的直徑有一個(gè)較小的影響，這些影響。相對(duì)于一個(gè)特定的物鏡（或正或負(fù)）的光程差和試樣的大小，形狀和結(jié)構(gòu)有顯著影響的嚴(yán)重程度的鹵素和陰影的影響。此外，這些影響是嚴(yán)重影響物鏡，放大倍率較低，產(chǎn)生更好的圖像。

結(jié)論

相襯是一個(gè)極好的方法用于增強(qiáng)薄的，透明的標(biāo)本對(duì)比度而不損失分辨率，并已被證明是一個(gè)有價(jià)值的工具的研究在活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)事件。此前引進(jìn)相對(duì)比度光學(xué)系統(tǒng)，電池和其他半透明的標(biāo)本進(jìn)行呈現(xiàn)在明顯微鏡可見的由人工染色技術(shù)。雖然這些標(biāo)本可以被觀察和記錄與暗場(chǎng)和斜照明，或散焦明場(chǎng)顯微鏡，這種方法已被證明是不可靠的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能提供關(guān)鍵信息。

相襯的技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)研究，尤其是在整個(gè)領(lǐng)域的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)。因此，該方法被用來研究活細(xì)胞，組織，并在光照下是透明的微生物。相襯使內(nèi)部的細(xì)胞成分，如膜，細(xì)胞核，線粒體，主軸，有絲分裂器，染色體，高爾基體，和來自植物和動(dòng)物的細(xì)胞和組織容易地可視化的胞質(zhì)顆粒。此外，相襯顯微鏡被廣泛采用在診斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，動(dòng)力學(xué)，和行為的各種各樣的活細(xì)胞培養(yǎng)。專業(yè)長(zhǎng)工作距離相襯光學(xué)系統(tǒng)已經(jīng)開發(fā)倒置顯微鏡組織文化調(diào)查。相襯觀察的好處是血液學(xué)，病毒學(xué)，細(xì)菌學(xué)，寄生蟲學(xué)，古生物學(xué)，海洋生物學(xué)在生物領(lǐng)域的其他地區(qū)。

相襯的工業(yè)和化學(xué)應(yīng)用包括礦物學(xué)，結(jié)晶學(xué)，聚合物形態(tài)調(diào)查。無色微晶粉末，顆粒狀固體，結(jié)晶性聚合物，具有只有輕微的環(huán)繞浸沒液體的折射率不同，往往容易被使用相差顯微鏡觀察。事實(shí)上，定量折光率往往利用取得的折射率值，用于識(shí)別物鏡。相位對(duì)比光學(xué)技術(shù)審議的其他的商業(yè)產(chǎn)品包括粘土，油脂，油，肥皂，涂料，顏料，食品，藥品，紡織品，纖維和其他纖維。

入射光相襯顯微鏡，雖然在很大程度上取代了微分干涉對(duì)比技術(shù)，用于檢查的表面，包括集成電路，晶體位錯(cuò)，缺陷和光刻。一個(gè)很好的例子是在硅外延片，半導(dǎo)體產(chǎn)業(yè)有巨大的意義堆垛層錯(cuò)。在反射光中的相襯系統(tǒng)中的照明的環(huán)形帶，一個(gè)圖像被投射到的物鏡，其中的相位板通常位于后側(cè)焦點(diǎn)面。此外，該相位板的位置不在物鏡之內(nèi)，但由一個(gè)輔助的透鏡系統(tǒng)，以避免所產(chǎn)生的相位板的反射和散射而形成的后焦平面的圖像。應(yīng)當(dāng)指出，在反射光的相差顯微鏡，相差從救濟(jì)產(chǎn)生的試樣表面上，而不是試樣內(nèi)的相梯度。

減少的光環(huán)和陰影關(guān)閉文物仍然是一個(gè)主要關(guān)注相襯顯微鏡。變跡相位板是用于減少嚴(yán)重暈，和專門的可變相位對(duì)比系統(tǒng)，可以微調(diào)，以控制這些影響，以優(yōu)化圖像質(zhì)量和技術(shù)所獲得的信息的保真度。發(fā)展*的相襯系統(tǒng)提供精確的測(cè)量相標(biāo)本具有大光路的差異，以及與其他的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)的結(jié)合觀測(cè)也有相當(dāng)大的興趣。特別相襯往往利用熒光成像，熒光團(tuán)確定的位置，并有望增強(qiáng)對(duì)比度，在光學(xué)顯微鏡。