尼康顯微鏡，標本的準備和圖像
大部分來自那些已經(jīng)過多年開發(fā)與傳統(tǒng)的寬視場顯微鏡使用的程序準備和共聚焦顯微鏡成像標本。 在開發(fā)一個新協(xié)議標本共聚焦顯微鏡成像*好的辦法是開始與一個已知是適合傳統(tǒng)的顯微鏡，并根據(jù)需要修改它。
無論協(xié)議的試樣制備，共聚焦顯微鏡進行的方式所產(chǎn)生的一個主要好處是在圖像顯示和分析的結(jié)果，從多個圖像的同時采集到計算機中，以數(shù)字形式的靈活性。 這在下面更詳細討論的，但一個優(yōu)雅的例子在圖1中，一個三元組標記的果蠅胚上面的蜂窩胚盤階段的圖像顯示的可能性。 該標本的免疫熒光抗體標記的三種不同的蛋白質(zhì)。 后三個對應(yīng)的圖像的紅色，綠色和藍色通道的共聚焦系統(tǒng)中，收集的圖像可以被重新排列，通過將它們復(fù)制到不同的通道。 通過評估從合并的三個，*有效的顏色示出的各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的信道分配產(chǎn)生的圖像被選擇。圖1給出了合并后的三通道圖像（組合紅色，綠色和藍色通道）。
已證明是成功的，在傳統(tǒng)的寬視場光學顯微鏡標本制備的一種方法，特別針對減少聚焦熒光的量，因為這將產(chǎn)生圖像中的喇叭形，大大降低了分辨率的功能還。 由于共焦方法所實現(xiàn)的光學切片，共聚焦顯微鏡相比，傳統(tǒng)的落射熒光顯微鏡undersamples在厚的樣品的熒光。 其結(jié)果是，樣品可能需要增加染色時間，著色劑的濃度進行共焦分析，如果在常規(guī)的顯微鏡評估，可能會*過被污染的。
雖然在典型的激光掃描共聚焦系統(tǒng)中的照明似乎是極其明亮的，在任何給定的點在試樣上的平均照度相對溫和，由于這樣的事實，多點每秒掃描。 在一個典型的1.6微秒的每一個點的掃描速度，在任何給定的點的實際的照明一般小于在傳統(tǒng)的寬視場落射熒光顯微鏡。 它通常是*好用*低的實用的激光功率，為了保護熒光成像。 雖然許多協(xié)議包括antibleaching的代理，防止褪色的熒光物種，可能并不需要這樣的添加劑與許多更現(xiàn)代的共聚焦工具。
共聚焦顯微鏡的主要優(yōu)點和應(yīng)用更厚的試樣是在改進的成像能力，雖然成功試樣的特定屬性可以是有限的。 若干試樣的*小物理要求適用，它必須適應(yīng)上的顯微鏡載物臺，和感興趣的區(qū)域必須是能夠被放置在所述物鏡的工作距離范圍內(nèi)。 在某些情況下，分辨率可能受到損害，以容納一個標本，以避免損壞或物鏡。 例如，可以具有一個高分辨率的鏡頭，如60倍的數(shù)值孔徑為1.4的工作距離為170微米，而20倍（具有典型的數(shù)值孔徑為0.75），可以提供一個相對較大的660微米的工作距離，與能夠訪問更多的禁區(qū)的標本，沒有實物形態(tài)的干擾。
的試樣，具有三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是用共聚焦顯微鏡研究，有可安裝在這樣一種方式，以保持結(jié)構(gòu)。 某種形式的隔離物，如漁線或蓋玻片一塊，通常放在載玻片和蓋玻片之間，以避免變形的試樣。 當活體標本的研究，它通常是必要的，將它們安裝在一個腔室，可提供對生命的所有必要的要求，也將允許通過物鏡的圖像所需的區(qū)域的足夠的訪問。
物鏡參數(shù)和光學部分的厚度
| | |||||||||||||||||||||||||||||
| | |||||||||||||||||||||||||||||
表1
試樣屬性，會影響，如不透明度和濁度，透光性，可以極大地影響到試樣中的激光束的穿透深度，因此結(jié)構(gòu)可以成像。 未定影的和未染色的眼睛的角膜上皮細胞，例如，是相對透明的激光束穿透到約200微米的深度。 與此相反，未定影的皮膚相對不透明的散射光，限制了激光穿透至約10微米。 許多固定的協(xié)議，旨在提高組織的透明度，包括某種形式的結(jié)算代理。
如果無法實現(xiàn)足夠的激光穿透整個安裝試樣，厚的部分可以用切片機切割。 通常使用固定的組織切片，但vibratome的組織（如活腦）中已經(jīng)減少了，并成功地成像。 為了獲得部分安裝的部位較深，可以從幻燈片中取出試樣，反轉(zhuǎn)它，并重新安裝它，但是這通常不是很成功。從檢體的深部的圖像，可以通過以下方式獲得使用被激發(fā)的染料，在較長的波長（例如花青5），相對于那些需要更短的波長的激發(fā)。 然而，使用較長波長的照明，將略微減少相比，在更短的波長獲得的圖像，可以實現(xiàn)的*大分辨率。 出于類似的原因，多光子成像技術(shù)允許從更深的層次內(nèi)的標本（由于采用紅光激發(fā)）收集的圖像。
物鏡
對于共焦顯微鏡的研究中，所使用的物鏡的選擇是極其重要的，作為聚光的能力的透鏡，作為其數(shù)值孔徑，測量的分辨率和光學部分的厚度的一個決定因素。 持有其他顯微鏡變量的常數(shù)，物鏡的數(shù)值孔徑越高，越薄的光學部分。 作為在一個特定的儀器，使用60倍的光學部分的厚度設(shè)定在1mm針孔的直徑是約0.4微米，并與16倍（0.5）透鏡的數(shù)值孔徑（數(shù)值孔徑為1.4）的目標，具有相同的1 - 毫米針孔，切片厚度為1.8毫米的順序。 通過打開較大直徑的針孔，光學部分的厚度可以增加。 表1給出了各種客觀鏡頭的光學部分的厚度值（微米），在兩個不同的針孔直徑為物流及供應(yīng)鏈管理應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心的一個模型。 圖像分辨率始終是較差的垂直比水平。 例如，使用60倍，1.4的數(shù)值孔徑，物鏡的水平分辨率是約0.2微米，約0.5微米的垂直分辨率。 場的平整度和色差物鏡選擇時要考慮額外的鏡頭特性。 色像差校正的程度是特別重要的成像時，在不同的波長的多標記標本。
物鏡分辨率*高的，有能力的，一般是那些具有*高的放大倍率和數(shù)值孔徑*高。 它們也是*昂貴的，所以往往是由掃描試樣的區(qū)域和該區(qū)域中，可以實現(xiàn)的*大分辨率之間的一個折衷辦法。 如果成像昆蟲的胚胎和成蟲磁盤的，例如，4倍的透鏡可能被用于定位試樣在幻燈片上，16倍（數(shù)值孔徑為0.5）鏡頭成像的整個胚胎，和40倍（數(shù)值孔徑為1.2）或60倍（數(shù)值孔徑為1.4）鏡頭為解決個別細胞核內(nèi)胚胎或成蟲磁盤。 4倍的鏡頭對于成像較大的組織，如蝴蝶成蟲磁盤的，將有助于整個翼磁盤，和解決單個細胞的40倍或60倍的。 圖2（a）示出了使用了4倍的目標取得整個蝴蝶五齡翼成蟲盤的整體圖，和16倍的透鏡（圖2（b））所提供的額外核的細節(jié)。 可以結(jié)合高分辨率和大圖像視野的一種方式是從鄰近地區(qū)獲得許多圖像，并結(jié)合成蒙太奇數(shù)字。 有些顯微鏡自動化XY階段，可以設(shè)置走動標本和收集多個圖像到大面積的蒙太奇。
大多數(shù)LSCMs有特征的更有用的功能之一是能夠進行放大的圖像，使用相同的物鏡，不喪失決議。 此功能是簡單地通過降低由激光掃描試樣的面積，通過掃描鏡的控制，同時保持相同的圖像的顯示尺寸或存儲器存儲陣列大小，有效地增加放大倍率。 這樣，多個放大倍數(shù)不干擾樣品或參考點的視場中的丟失的情況下實現(xiàn)與單透鏡。 然而，在可能的情況下，更高的數(shù)值孔徑的透鏡應(yīng)可以使用，以達到*高的清晰度，而使用較低的數(shù)值孔徑的透鏡的變焦比。的能力的單透鏡（40倍）放大示出圖2中的（cf）。 的數(shù)字顯示面板（C）40倍的目標（比16x的圖（b））提供額外的核細節(jié)。 面板（d）到（f）是通過以下方式獲得相同的累進透鏡，通過減少在試樣上的掃描區(qū)域40倍變焦的圖像。
共聚焦儀器設(shè)計有一些限制聚焦的光到達檢測器的一個可調(diào)節(jié)的針孔。 打開較大直徑的針孔產(chǎn)生更厚的光學部分和降低分辨率，但往往是必要的，以包括更多的標本細節(jié)或增加撞擊檢測器的光。 由于針孔的關(guān)閉（縮徑），光學部分的厚度和亮度降低。 分辨率的提高，直至達到目標的*小的針孔直徑，*過該分辨率不增加，但亮度繼續(xù)減小。 在此條件下達到的針孔直徑為每個物鏡是不同的。
共聚焦成像探頭
共焦儀器的發(fā)展繼續(xù)影響力，又能受到新的熒光探針的合成，提高免疫定位。 熒光染料被引入，有更密切地相匹配的由激光器產(chǎn)生的波長與大多數(shù)商業(yè)LSCMs供給的激發(fā)和發(fā)射光譜。不斷發(fā)展改進的探頭，可以結(jié)合目前的研究興趣抗體。 的花青染料組作為一個例子，作為替代品其他歷史悠久染料的開發(fā)，作為一個美好的替代羅丹明菁3，找到越來越多地使用在三重品牌戰(zhàn)略菁5。
熒光原位雜交（FISH）探針檢測分辨率和靈敏度方面具有優(yōu)勢進一步增強時與激光掃描共聚焦顯微鏡，成像熒光標記的DNA和RNA序列在細胞中的分布是一個有價值的方法。 此外，明亮的熒光探針，目前可用于在兩個原子核和孤立的染色體總DNA的激光共聚焦顯微鏡成像。
大量熒光探針可結(jié)合在相對簡單的協(xié)議，當目標的細胞器和結(jié)構(gòu)，特別是染色。 可用探針之間的過多的染料，的標簽細胞核，高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，染料如熒光標記的phalloidins，目標聚合的肌動蛋白在細胞中。 這種染料是非常有用的，在多個標簽的方法來定位感興趣的抗原在細胞中具有特定的隔間。 例如，圖3給出了就業(yè)相結(jié)合的鬼筆環(huán)肽和核染料（TOPRO）的蝴蝶蛹翼成蟲磁盤應(yīng)用到整個坐騎在三重標簽計劃與相應(yīng)的抗原。 圖3（a）所示，鬼筆可以用來強調(diào)在發(fā)展組織的細胞輪廓，與周邊肌動蛋白小梁被標記為明亮的熒光環(huán)。面板（B）的數(shù)字說明了戲劇性的特異性核染料標記只是一個細胞成分。 除了本細胞區(qū)室的標記策略，可以有益地包括已知的分布或功能的細胞（例如抗微管蛋白）的蛋白質(zhì)的抗體在多標記研究。
如果活細胞成像，關(guān)鍵是要認識到系統(tǒng)中添加熒光染料的效果。 這些探頭可以活細胞毒性，尤其是當他們用激光激發(fā)。 毒性的影響降低到細胞培養(yǎng)基中添加抗壞血酸在一些準備協(xié)議。在成像過程中的特定的被標記的細胞成分，可能會影響細胞的生存能力。 例如，細胞核的污漬通常有更多的有害影響比細胞質(zhì)染色。 探頭可以區(qū)分活細胞和死細胞（其中，吖啶橙），在成像過程中，可用于檢測細胞活力。 大多數(shù)這樣的檢測方法是基于的前提時，死細胞的膜是可滲透的許多材料，如染料，這是不能穿透生活狀態(tài)。
螢光-3和RHOD-2已被合成，改變自己的某些離子，如鈣離子的存在下的熒光特性的染料的例子。 新的探針已被開發(fā)用于成像基因的表達，包括，例如，水母的綠色熒光蛋白（GFP），這使觀察體內(nèi)的基因表達和蛋白質(zhì)的定位。 GFP的使用，使基因表達的監(jiān)測，在許多不同類型的細胞，包括起居室果蠅卵母細胞，哺乳動物細胞和植物（使用激光掃描共聚焦顯微鏡的激發(fā)激光的488nm的線）。 GFP用頻譜發(fā)生變化的突變體可用于在multilabeling實驗，并且這些人還發(fā)現(xiàn)了用于避免干擾的在生物體組織的自體熒光。
自體熒光
在許多類型的細胞中自然發(fā)生的組織的自體熒光，并且可以在成像過程中的背景干擾的主要來源之一。 例如，在酵母和植物細胞中的葉綠素熒光的紅色部分的光譜。 某些試劑如戊二醛固定劑，是源的自體熒光，這可以減少用硼氫化鈉處理。 有時可避免使用熒光基團，可以是天然的自體熒光的范圍內(nèi)的波長被激發(fā)自體熒光。 花青5經(jīng)常被選用，因為它是在較長波長處，避免了更短的波長的自發(fā)熒光激發(fā)。
雖然它是*經(jīng)?？紤]的一個問題，組織的自體熒光，可用于成像的整體細胞形態(tài)作為的multilabeling研究的一部分。 自發(fā)熒光的總熒光的貢獻可以評估通過查看未染色標本在不同的波長，并指出黑電平增益的激光功率和PMT設(shè)置。 往往可以自體熒光漂白，在高功率激光，或通過泛濫的標本汞燈的光從一個簡短的接觸。 包括使用更復(fù)雜的方法來處理自體熒光時間分辨成像，或利用數(shù)字圖像處理技術(shù)，如圖像減法去除。
收錄圖像
開始共聚焦顯微鏡的用戶可以在幾個方面獲得經(jīng)驗。 顯微鏡通常由制造商提供的手冊包含了一系列必要的程序簡單，入門。 大多數(shù)多用戶設(shè)施的主要負責人，操作儀器，可提供定向會議，或者設(shè)施經(jīng)理可能需要有一定的專業(yè)水平獨奏使用儀器前進行短期培訓(xùn)和示范。 應(yīng)特別注意支付給該設(shè)施的內(nèi)部規(guī)則。 顯微鏡公司進行的培訓(xùn)課程，從顯微鏡的工作坊，也可以得到的信息和培訓(xùn)，并從各種出版物。
與實驗標本工作之前，至關(guān)重要的是要熟悉所涉及的攝像系統(tǒng)的基本操作。 它通常是一個相對容易的標本，而不是一個更困難的實驗之一，有利于新手開始試成像。 一些更好的測試樣品包括紙浸在一個或更多的熒光染料或熒光珠的制備。 這兩種類型的試樣是明亮的熒光和共聚焦系統(tǒng)的圖像比較容易。 另一個出色的樣品表現(xiàn)出的自體熒光在許多不同波長的混合花粉的幻燈片。 這些可以容易地制備園林植物花粉，或可從商業(yè)供應(yīng)商的生物樣本。 同時，相同的光電倍增管的黑電平，增益，和針孔的直徑設(shè)置在圖4中的花粉粒圖像采集，但揭示了三種類型的花粉，每個熒光在不同的激發(fā)波長。 這些標本作為測試對象是有價值的，因為他們不僅有一些有趣的表面細節(jié)，還能保持其性能相對較好時，接觸到的激光束。 活體組織標本制備洋蔥上皮或水植物伊樂藻的試驗。 是可靠的，可以使用自體熒光或與染劑DiOC6染色。
聚焦儀器在嘗試成像之前，應(yīng)設(shè)置盡可能*佳的性能。 這需要*優(yōu)比對，特別是當一個正在使用的舊的共聚焦顯微鏡。 使用的校準程序，是非常具體的特定工具，通常是*好的人誰擁有全面負責維護。 在任何情況下，應(yīng)對準嘗試沒有適當?shù)挠?xùn)練，從顯微鏡的所有者和權(quán)限。用于嘗試對準的程序不當可導(dǎo)致完全喪失的光束，一些儀器的情況下，可以要求上門服務(wù)，以糾正。
共焦系統(tǒng)是基于傳統(tǒng)的光學儀器，光學顯微鏡的基本程序和慣例，在任何時候，應(yīng)遵循。 這是非常重要的，在光路中的所有玻璃表面清潔，因為灰塵，油污，或潤滑脂，載玻片，蓋玻片，物鏡圖像不佳的主要原因。 在物鏡和標本之間的折射率必須是適合于所使用的鏡頭。 例如，正確的浸油，必須使用對于一個給定的物鏡的數(shù)值孔徑，試件必須被安裝成在透鏡的工作距離。 蓋玻片的厚度必須是正確的，所使用的透鏡，特別是對較高的功率目標，要求第1“或”否“，而不是第2號1.5蓋玻片。 蓋玻片必須密封，以使用合適的培養(yǎng)基中滑動，安裝在平坦的。 指甲油可用于固定的標本，如果采取審慎態(tài)度，以確保它是干的前成像。 將凡士林，蜂蠟，羊毛脂，或一些其他的無毒密封材料，必須使用與活標本。 經(jīng)過嚴格的基本清潔程序在樣品制備階段，可以節(jié)省大量的時間和精力。
在聚焦模式下成像的準備，一個地區(qū)的利益所在，無論是明場或使用傳統(tǒng)的熒光顯微鏡。 另外，優(yōu)選使用的共聚焦系統(tǒng)的顯微鏡做這個調(diào)查，但對于新手來找到正確的焦平面單獨使用共焦成像模式，它可以是非常困難的。 如果傳統(tǒng)的成像模式是不可用的共聚焦系統(tǒng)上，然后結(jié)構(gòu)還可以使用一個單獨的熒光顯微鏡定位，它們的位置標使用的鉆石在顯微鏡上的標記，標記筆，或通過記錄的位置坐標從顯微鏡階段。 這是特別有用是能夠預(yù)覽與實際的共聚焦系統(tǒng)的顯微鏡標本，當試圖圖像一個罕見的現(xiàn)象，如在一個特定的發(fā)展階段表達的基因，在檢體可能包含數(shù)百個不同年齡的胚胎的。 大量的時間可以以這種方式保存，過有許多標本，使用共焦模式掃描。 共聚焦工具通常有一個低分辨率的快速掃描模式，使得初步掃描更高效。 ，但是，搜索很少發(fā)生的事件時，*好的方法是使用傳統(tǒng)的顯微鏡檢測模式，然后立即切換到共焦模式下，在相同的顯微鏡圖像收集掃描的幻燈片。
掌握的“秘密”依賴于成功的共焦成像的物鏡的數(shù)值孔徑，針孔的大小，圖像的亮度，并使用*低的激光功率可以達到*佳的圖像之間的相互作用。 新手用戶應(yīng)該試驗用試樣和試件幾個不同的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑的物鏡來獲得，然后再嘗試成像實驗標本的顯微鏡的能力感改變這些參數(shù)。 應(yīng)使用變焦功能與使用具有更高的數(shù)值孔徑的目標所得到的共聚焦系統(tǒng)的圖像獲得的比較。 特定的樣品和功能成像，將決定哪些鏡頭和方法是*合適的。 適合于激光共聚焦顯微鏡的許多目標的兩個例子示于圖5。 數(shù)字包括一個60x planapochromat的油浸鏡頭和20倍planfluorite的。 后一目標的調(diào)整軸環(huán)，它允許利用油，甘油，或水作為液浸介質(zhì)。
特定的顯微鏡設(shè)置適當?shù)脑嚇討?yīng)設(shè)立相差的主要感興趣的區(qū)域，以避免在有價值區(qū)域的試樣的熒光物種的光漂白。 這通常需要設(shè)置光電倍增管檢測器的增益和黑電平與針孔的大小，以獲得可接受的分辨率和足夠的對比度之間的*佳平衡，使用*低的激光功率，以盡量減少光漂白。 許多儀器利用顏色查找表的設(shè)計，以幫助設(shè)置正確的動態(tài)范圍的圖像。 這樣的表的設(shè)計，使*暗的像素，亮度值在零附近，是*********示為綠色（例如），各路像素的亮度值在255附近在8位系統(tǒng)，會顯示為紅色。 該顯微鏡的參數(shù)，例如增益，黑電平，和針孔的直徑，調(diào)整，以便有只有少數(shù)綠色和紅色的像素在圖像中，確保利用從0到255的全部動態(tài)范圍，但很少截止亮度范圍的任一端。 雖然這些調(diào)整，可通過肉眼，在極端的使用偽彩色成像系統(tǒng)的動態(tài)范圍，使調(diào)整變得較少主觀。 在某些情況下，圖像必須被收集以低于全動態(tài)范圍的系統(tǒng)，因為必須使用小于*佳激光功率或檢體有不均勻的熒光，導(dǎo)致掩蓋感興趣的幀中的調(diào)光區(qū)域的明亮區(qū)域。
在掃描過程中的檢體的圖像的平均例程，通常采用降低隨機噪聲的檢測系統(tǒng)，并加強固定（非隨機的）圖像中的特征。 一種圖像均衡算法可以應(yīng)用于后采集的圖像縮放它們的全動態(tài)范圍的顯示。 應(yīng)小心，要應(yīng)用此不同的例程如果施加均衡例程之前，除非在控制圖像被包含在同一幀中作為實驗用圖像進行熒光強度的測量。 在使用任何類型的圖像處理程序，它是一個很好的策略，以節(jié)省任何處理的原始未處理的圖像。
圖像采集通常的策略是將圖像保存到共聚焦系統(tǒng)的計算機的硬盤上，以后將它們備份到其他大容量存儲設(shè)備。 一般來說，它始終是*好，顯微鏡會話期間盡可能收集盡可能多的圖像，并放棄不必要的，在以后的審查。 許多似乎是不必要的圖像，首先考慮進一步審查后，在以后的日子（尤其是與同儕）變得非常有價值。 如果它似乎浪費看似多余的圖像，考慮它更難準備另一標本，更難重現(xiàn)精確的實驗條件，或什至完全復(fù)制的樣品制備協(xié)議。
成像開始之前，應(yīng)制定的策略標記圖像文件信息的方式。 在成像過程中，許多票據(jù)應(yīng)采取或隨著圖像添加到圖像文件中，如果這種能力是可以使用的系統(tǒng)。 應(yīng)該做的測試，以確保訪問任何保存的信息是保存圖像后，牢記時，它隨后被轉(zhuǎn)移到NIH圖像或Adobe Photoshop的圖像編輯程序，如文本和圖像相關(guān)的其他信息，可能會丟失其他電腦。 一個組織良好的筆記本電腦或筆記本電腦上的文件可能會優(yōu)于其他方式記錄成像會話的詳細信息，并應(yīng)包括文件名，注釋和細節(jié)的目的和任何用于允許在稍后的日期計算比例尺的縮放因子。 ，大多數(shù)聚焦系統(tǒng)不自動記錄使用的物鏡，這個信息是非常重要的用于計算字段寬度和后出版的比例尺。 許多現(xiàn)代系統(tǒng)利用圖像數(shù)據(jù)庫的組織的文件的文件名和位置，通常會顯示圖像文件的縮略圖。 必須小心，按照圖像的命名系統(tǒng)所施加的限制，如允許在文件名中的字符和句點或空格字符，如是否可能被誤解的軟件。
故障排除
任何實驗學科，協(xié)議已經(jīng)產(chǎn)生了良好的效果有時會莫名其妙地停止工作。 共聚焦成像實驗，當發(fā)生這種情況，有可能是初始反射怪的工具，而不是標本，但應(yīng)進行測試，以確認該標本進行任何故障診斷儀器上開始之前沒有過錯。 一個很好的*次測試是在傳統(tǒng)的落射熒光顯微鏡查看樣本。 如果某些熒光是肉眼可見的，功能正常的共聚焦系統(tǒng)的信號應(yīng)該是非常光明的。 經(jīng)確認，熒光標本中存在，然后做一些測試的共聚焦系統(tǒng)使用已知的試驗片，而不是實驗。 為便于參考，在共焦系統(tǒng)應(yīng)該有一個數(shù)字文件訪問的用戶的顯微鏡，包括其收集的所有參數(shù)，如激光功率，針孔的直徑，物鏡和變焦值和增益的測試試樣的圖像，并黑電平檢測器。
如果初步測試不提供明確的解決方案，它是*好的專家誰可能遇到的問題以尋求幫助。 作為一項規(guī)則，如果用戶是不知道的東西，它是*好的，他們退后一步，并尋求幫助，然后再嘗試任何補救措施。 共聚焦顯微鏡的所有公司提供的熱線電話和提供額外的幫助，可以訪問網(wǎng)站。
被跟蹤的制備協(xié)議的問題，通常所造成的降解的試劑，并通過進行一系列的診斷測試，應(yīng)檢查。它通常是*好的人做實驗，以彌補自己的試劑，或至少要取得他們的信任的同事。抗體應(yīng)分配的冷凍小批量的股票，然后將其存儲在冷藏條件下，不應(yīng)該被重復(fù)使用，除非*必要的。有時稀有或昂貴的試劑，這是不可避免的，通常不會出現(xiàn)問題。
出血在多標記標本的實驗中，通過從一個通道到另一個可以作為試樣本身，或由于顯微鏡的問題的性質(zhì)的結(jié)果發(fā)生。在文獻中，應(yīng)征詢發(fā)布評論流血通過和可能的補救措施的原因的詳細信息。一個很好的測試儀器本身涉及成像試驗樣品與已知的流血通過屬性，同時使用多個標簽和單標簽設(shè)置。在測試樣品的圖像應(yīng)與所有相關(guān)的顯微鏡設(shè)置的記錄一起存儲，這樣，當問題發(fā)生時的試驗片可以重新與存儲的記錄，可被稱為當儀器相比具有相同的儀器條件和圖像成像*佳運行狀態(tài)。
當問題出現(xiàn)時，可以用其他的測試包括激光照明的顏色的激光的陽極電壓的檢查，目視檢查。如果，例如，氪/氬激光的光束掃描上的多個標簽設(shè)置時，呈藍色，而不是白色，那么這可能表明紅線弱。在這種情況下，陽極電壓可能會過高，通?？梢酝ㄟ^調(diào)整反射鏡的激光減少到可接受的水平。這種調(diào)整應(yīng)該做的，或監(jiān)督人負責維持共聚焦系統(tǒng)。如果電壓不能被帶入一個可接受的范圍內(nèi)，可能需要替換為激光。
中可能遇到的另一個問題是，抗體探針可以具有降低或需要進行再純化，或以其他方式清洗。已準備了一段時間的試樣，有可能發(fā)展增加背景熒光和由分離的第二抗體的熒光染料擴散到周圍組織中引起滲色。 如果可能的話，影像應(yīng)新鮮制備的標本。 有時候，改變濃度和/或熒光染料的分布，將有助于減輕問題。 作為一個例子，熒光素可能出血到若丹明通道，可以切換成使羅丹明上更強的信道。 這樣做的理由是，熒光激發(fā)光譜有一個尾，重疊和被激發(fā)在若丹明波長范圍。 在隨后的實驗中，輔助的濃度可以減少。
圖像處理和出版
共聚焦顯微鏡獲得的圖像通常保存為數(shù)字格式，使他們能夠使用共焦系統(tǒng)的一部分提供的專有軟件很容易被操縱的計算機中的文件。 的*顯著提高的當前LSCMs能力之一是它們的共聚焦圖像的顯示。 這是非常重要的，因為改進利用共聚焦顯微鏡成像的價值不大，如果有沒有辦法有效地顯示圖像硬拷貝或復(fù)制。
*近5年左右前大多數(shù)實驗室仍在使用傳統(tǒng)攝影暗房和化學處理的薄膜和紙張，其*終的硬拷貝圖像。 再現(xiàn)彩色圖像有特別的困難，因為他們通常由獨立的打印機通常很少有想法什么構(gòu)成正確的色彩平衡的顯微印刷和打印質(zhì)量的成本很高。 要取得現(xiàn)在的硬拷貝圖像，圖像文件可以導(dǎo)出到一個幻燈片打印機，彩色激光打印機，或出版打印質(zhì)量的染料升華打印機，直接控制被收購人保持圖像特征圖像。 可以直接打印照片或幻燈片，視頻監(jiān)視器屏幕，可以在Web上發(fā)布和電影序列。
現(xiàn)在大多數(shù)期刊都能夠接受的數(shù)字圖像文件的發(fā)布，這導(dǎo)致發(fā)布的圖像質(zhì)量顯著改善。由共聚焦成像系統(tǒng)的圖像質(zhì)量達到現(xiàn)在可以在發(fā)表的文章中更忠實地再現(xiàn)。在某些情況下，期刊也使他們的文章可以用CD-ROM，這意味著讀者可以訪問發(fā)布的圖像，正是因為他們對那些做研究的共聚焦系統(tǒng)采集時出現(xiàn)。毫不奇怪，圖像采集，顯示和發(fā)布的技術(shù)進步現(xiàn)在可以準確地再現(xiàn)圖像的原始分辨率和色彩平衡，從理論上說，在低得多的成本向筆者特別有利的情況下，在該刊物上的彩色圖像。