尼康顯微鏡：共焦反射顯微鏡的基礎知識

當許多生物醫(yī)學研究認為“共聚焦顯微鏡”，他們通常有熒光成像技術的初衷。 這個看似明顯的聯系，這是一個很好的理由。 大部分常見的生物醫(yī)學應用共聚焦顯微鏡利用光學切片功率，結合精湛的特異性免疫熒光或熒光原位雜交（FISH）乘標記的細胞和組織產生更好的圖像。

可以利用共焦反射鏡，以收集更多信息相對點點額外的努力，因為從標本的技術要求*低的樣品制備和儀器重新配置。 此外，未染色的組織的信息是現成的共焦反射鏡，作為數據標記探針的組織反射光線。 該方法還可以結合使用，與比較常見的古典熒光技術。 后者的應用程序的例子是在一個群體中的熒光標記的細胞和未標記細胞的檢測成像不透明的，圖案化的基質上生長，如在圖1中示出的熒光標記的細胞之間的相互作用。

數字圖像在圖1（a）示出了神經膠質細胞，小1微米高的支柱圖案，并使用反射共聚焦顯微鏡成像的硅基質上生長。 細胞免疫熒光標記紐（紅色）和膠質纖維酸性蛋白（GFAP，綠色）。 圖1（b）示出了類似的硅基質上生長的神經元和標記的抗體，該抗體，微管相關蛋白-2（MAP-2）和熒光素標記的二次抗體。 同樣地，在硅基材的表面成像的共焦反射鏡。

生物醫(yī)學成像的共焦反射鏡的一個主要誘惑是的圖像無標簽的活組織能力。 事實上，該技術已被利用的各種不同的組織中，包括腦，皮膚，骨，牙齒，眼組織的圖像。 共焦反射顯微鏡成像的眼的角膜和晶狀體的效果特別好，因為它們是透明的。 例如，光學部分已收集到客廳使用工作距離長水浸泡目標的角膜和晶狀體深400微米。

成像未染色標本共焦反射鏡設計師早期焦工具螢光技術出現之前是非常常見的。 可以利用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）和尼普科夫旋轉盤顯微鏡，共聚焦反射模式。 旋轉盤顯微鏡的圖片可實時收集的，實際的顏色觀察，具有的優(yōu)點和不足，有時會出現在激光掃描共聚焦顯微鏡的反射工件。 此工件出現在圖像中的一個亮點，從顯微鏡中的光學元件中的一個或多個反射所造成的。 反射的神器有幾種補救措施。 它可避免通過相差顯微鏡的光軸的亮點和縮放的幀掃描的區(qū)域中的試樣。 另外，反射可以從圖像中刪除數字中減去背景圖像的光斑或平場校正。 除去麻煩工件的另一種方法，應用儀器，以消除從光學元件的反射偏振濾光器。

傳統(tǒng)的生物應用廣角反射光成像，觀察生長在組織培養(yǎng)中使用的技術稱為反射干擾顯微鏡的蓋玻片上的細胞之間的相互作用。 這里，粘連細胞和它的基質之間的界面處的玻璃蓋玻片和底面的細胞可見。 這些細胞粘附地區(qū)繼續(xù)成為一個研究領域的極大興趣。 與聯絡接觸相關的蛋白質是利用免疫熒光分析，接觸本身可以被視為使用干擾反射鏡。

以類似的方式，使用共焦反射鏡觀察細胞基質粘連，如在圖2中示出。 再次，蓋玻片和小區(qū)之間的界面成像。 該表面可以在共焦顯微鏡下難以定位，但在聚焦作為一種輔助手段，可以采用高反射率的蓋玻片。 細胞基質接口可以位于集中在快速掃描模式，并出現粘連剛過蓋玻片明亮的閃光穿透細胞層時。 護理應注意不要*載對焦時，以這種方式從非常明亮的蓋玻片表面的光電倍增管。

圖2給出了干擾反射共焦反射鏡技術拍攝的數字圖像。 圖2（a）示出了一個單一的光學部分雞的心臟成纖維細胞在細胞 - 基質界面成像。 上面的外周的細胞接觸斑的暗條紋。 圖2中所示類似的單元格中的一項的 xz邊的（a）的圖2（b）中所示。 請注意，在圖2（b）的蓋玻片是非常光明的。 這似乎聚焦顯微鏡（紅色箭頭）時，閃光燈的閃光，細胞基質接口后直接成像。

*近，使用相關技術，提高了圖像的絲狀偽足收集更反映基板上生長的細胞從PC12細胞（大鼠嗜鉻細胞瘤）。 的技術，稱為反向散射增強反射共焦顯微鏡 ，產生類似于收集使用傳統(tǒng)的微分干涉對比顯微鏡（DIC）的圖像。 使用這種方法，可以觀察未染色的細胞生長在不透明的基質，如硅芯片，是不可能的一種技術，它與傳統(tǒng)的透射光DIC成像。

使用反射光，而不是熒光，活細胞成像的優(yōu)點之一是沒有漂白文物的反射光模式。 還是應該注意光損傷的活標本的威脅，然而，和所有活細胞成像時的注意事項，應采取。 已成功地利用共焦反射鏡， 在體外通過膠原基質和膠原纖維形成，Z系列使用時間推移成像和隨后的三維重建（被稱為4-D成像）按照細胞遷移。 這些方法利用膠原蛋白的生物聚合物的高反射率或反照率。

共焦反射鏡（時相比，共聚焦熒光成像）的一個缺點是缺乏特異性探針的差異反映多個標簽實驗。 這是很難改進的多波長的探針，可用于免疫熒光和活細胞成像。 探頭，可用于在反射光模式為單個標簽的實驗包括金顆粒，過氧化物酶標簽，和銀顆粒。

作為一個例子，共焦反射鏡原位雜交（圖3）制備試樣的放射自顯影成像銀顆粒比傳統(tǒng)的明或暗視野顯微鏡提供了顯著的改善。 該out-of-的聚焦信號從整個乳狀液中的銀顆?？梢杂行У叵c核糖核酸探針的光學切片的乳液使用共焦反射鏡的銀顆粒，從焦點對準的圖像。

如圖3所示的幾個數字圖像采集共焦反射鏡的實驗與銀顆粒。 標本外周血細胞原位雜交，用姬姆薩染色準備從艾滋病毒感染的個體。 圖3（a）示出制備根據標準明照明，而圖3（b）顯示了相同的暗場照明領域中有顯著量的焦點外的碎片。 共焦反射鏡（在同一視場）的結果列于圖3（三）。 需要注意的是還沒有在此模式下成像的焦點外的碎片。 為了比較的目的，樣品也可以用微分干涉對比成像，在明場和暗場照明。

因為收集的反射光的共聚焦圖像和所發(fā)送的圖像（明場和暗場）同時使用相同的掃描激光束（在圖3），它們是在與另一個寄存器，并可以進行數字合并成單個圖像。 的透射光的明視場圖像記錄的總的細胞種群，無論是作為一個灰度圖像或真彩色圖像（提供了一個真正的顏色的透射光檢測器被安裝在顯微鏡）。 暗場照明圖像采用了銀顆粒在完整的乳液，包括任何污染的玻璃表面上的塵埃顆粒的整個人口的信號。 反射共焦顯微鏡圖像，與此相反，只記錄標記的探針（圖3（c））的那些細胞，并因此比透射光圖像的標記的細胞是更準確的測量。 此外，它是更適合于探頭的量化，因為該圖像由黑色背景上的飽和像素（信號從探頭）的離散區(qū)域，有點讓人想起在這方面的熒光圖像。

共焦反射顯微鏡圖像數字合并透射光圖像顯示目的，標記細胞的細胞總人口的估計數。 在大多數共聚焦系統(tǒng)中，收集在一個通道的RGB圖像（通常是藍色通道）的透射光圖像，反射光圖像，熒光圖像或一個或多個與它同時被收集，通常成紅色綠色通道。 顯示以這種方式產生的透射光圖像的彩色背景上，在圖4（a）所示，一個典型的明場或DIC圖像或黑色背景上的暗場圖像的灰度級，而不是更熟悉的梯度。 將其粘貼到一個不同的層上使用的數字圖像編輯程序，例如Adobe PhotoShop的（在圖4（b）所示）的反射光圖像，可以通過以下方式獲得的透射光圖像的一個更為現實的版本。

除了熒光共焦反射鏡通常采用添加熒光圖像中查看時，隔離（特別是共焦熒光圖像，它可以包括幾個白色的像素上的黑色的海洋），它可以是相當抽象的上下文。 在上面給出的示例中，結合的特異性標記，免疫熒光和共聚焦顯微鏡的光學切片功率實際上可以妨礙的圖像本身的解釋，除非它們被數字合并的反射光，透射光或反染熒光圖像。

共焦反射鏡雖然有有限的應用在生物醫(yī)學成像，它有時可以提供額外的信息，從樣本反射光線或有重大波動的折射率在一定的邊界。 這種有用的技術，用透射光成像，可能是值得一試的熒光標記成像時，用共聚焦顯微鏡標本。