完全控制的穿透深度與徠卡顯微鏡TIRF自動(dòng)對(duì)準(zhǔn)
全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRF）的主要特點(diǎn)是激發(fā)熒光基團(tuán)，而不是使用直接光漸逝波的就業(yè)問(wèn)題。 倏逝波，而產(chǎn)生玻璃/水或玻璃/標(biāo)本接口的從屬性，是其傳播z方向逐漸降低，限制了它的穿透深度大約幾百納米的樣品。 這允許位于玻璃/水或玻璃/試樣界面附近的一個(gè)小體積的細(xì)胞完全被激發(fā)的熒光基團(tuán)。 研究人員普遍適用于全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像中的動(dòng)態(tài)事件和關(guān)閉，如囊泡運(yùn)輸，內(nèi)和胞外分泌和膜販運(yùn)到質(zhì)膜，無(wú)可比擬的信號(hào)噪聲比和Z-分辨率。 然而，所觀察到的分子或結(jié)構(gòu)，可靠控制的倏逝波的穿透深度的空間分布進(jìn)行精確的陳述是強(qiáng)制性的。
入射角和波長(zhǎng)的激光的穿透深度是由
倏逝波的穿透深度被定義為下降的倏逝波的界面處的初始強(qiáng)度的37％的范圍內(nèi)，仍可獲得。 它主要取決于激光的入射角遇到玻璃/水或玻璃/標(biāo)本接口。 因此，控制入射角度為必要的控制的倏逝波的穿透深度。 嚴(yán)密，精確，可靠和可重復(fù)性的激光的入射角控制也是強(qiáng)制性的，以確保所取得的成果的可重復(fù)性。 反過(guò)來(lái)的激光的入射角取決于在backfocal平面的目標(biāo)，這是由全內(nèi)反射熒光掃描儀的激光光斑的徑向距離。
圖 1：全內(nèi)反射熒光顯微鏡原理
漸逝場(chǎng)的穿透深度的另一個(gè)決定因素是必要的用于激發(fā)的激光的波長(zhǎng)。 這可以成為一個(gè)在TIRF實(shí)驗(yàn)問(wèn)題多個(gè)熒光。 在此類實(shí)驗(yàn)中不同的激光線之間切換，會(huì)導(dǎo)致不同的漸逝波的穿透深度。 從這樣的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的解釋，必須非常仔細(xì)地進(jìn)行，作為滲透的漸逝波，因此被激發(fā)的熒光團(tuán)的數(shù)目試樣的體積隨激發(fā)光波長(zhǎng)。 為了實(shí)現(xiàn)可靠的，可量化的結(jié)果，它是強(qiáng)制性的，以保持在一恒定值的倏逝波的穿透深度。 這只能實(shí)現(xiàn)激光線所產(chǎn)生的漸逝波，如果不同的穿透深度相應(yīng)地改變所選擇的激光線的入射角補(bǔ)償。
完全控制的穿透深度與徠卡TIRF自動(dòng)對(duì)準(zhǔn)
為了確保重復(fù)性和可靠的穿透深度，甚至當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)改變的倏逝波，萊卡微系統(tǒng)采用特殊的硬件TIRF對(duì)準(zhǔn)一個(gè)完全自動(dòng)化的過(guò)程。 的徠卡TIRF模塊的主要部分是一個(gè)全內(nèi)反射熒光掃描儀，準(zhǔn)直儀和TIRF傳感器的。 全內(nèi)反射熒光掃描儀控制被放置在所述激光束的客觀backfocal平面的位置。 因此，控制在試樣的激光的入射角度。 準(zhǔn)直的激光束進(jìn)行聚焦的后部目標(biāo)的平面（backfocal平面），實(shí)現(xiàn)了均勻的照明視場(chǎng)中。 的的TIRF傳感器檢測(cè)到的反射光的情況下，全內(nèi)反射從玻璃/標(biāo)本或玻璃/水相間。
圖 2：光通路徠卡TIRF模塊。 激光束被定位的目標(biāo)，借助于一臺(tái)掃描儀。 在一個(gè)特殊的傳感器測(cè)量的總反射的返回的光束。 這種反饋可以精確，全自動(dòng)，所產(chǎn)生的漸逝場(chǎng)的穿透深度和可重復(fù)的設(shè)置。 1）全內(nèi)反射熒光傳感器，2）TIRF掃描儀，3）準(zhǔn)直器，4）廣角熒光激發(fā)。 實(shí)線：耦合激光束，虛線：回來(lái)的激光束。
這使得全內(nèi)反射熒光傳感器系統(tǒng)的一個(gè)特殊的部分，因?yàn)樗试S待檢測(cè)的全內(nèi)反射的發(fā)生。 因此，實(shí)驗(yàn)者可以100％肯定，獲取的圖像，是真正的全內(nèi)反射熒光圖像。 在完全自動(dòng)化的對(duì)準(zhǔn)過(guò)程中，全內(nèi)反射熒光掃描儀的激光束移動(dòng)通過(guò)backfocal平面的目標(biāo)和全內(nèi)反射熒光傳感器，檢測(cè)范圍的掃描儀位置處發(fā)生全內(nèi)反射。 有了這個(gè)信息，然后系統(tǒng)計(jì)算 - 考慮到的激光束的波長(zhǎng) - 得到的所有可能的掃描儀位置的倏逝波的穿透深度。
后的對(duì)應(yīng)是可能的激光線之間切換，同時(shí)保持一個(gè)恒定的倏逝波的穿透深度時(shí)，掃描儀將自動(dòng)改變的客觀backfocal平面中的激光束的位置。 這保證了激光始終具有所要求的相對(duì)于波長(zhǎng)的激光的入射角度，以產(chǎn)生所要求的漸逝場(chǎng)的穿透深度。 結(jié)果可自由定義，但仍然穩(wěn)定，并充分的重復(fù)性滲透深度，可用于所有波長(zhǎng)的倏逝波。
圖 3：全內(nèi)反射熒光圖像的熒光標(biāo)記RAB11（綠色）和GAL3（紅色）的蛋白，在MDCK細(xì)胞頂膜囊泡。 與不同穿透深度設(shè)置的圖像被收購(gòu)。 左上：90納米，右上：110納米，中心左：150納米，中間偏右：200納米，左下：250納米，和底部右：EPI模式。 請(qǐng)注意可見(jiàn)小泡數(shù)量的增加和減少的信號(hào)對(duì)噪聲比。 徠卡上午TIRF MC系統(tǒng)獲取的圖像。 禮貌德國(guó)馬爾堡大學(xué)PHILIPPS，細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)研究所蘇菲博士Veitinger，。
靈活的TIRF掃描儀使河洛成像和方位選擇
雇用一個(gè)高度靈活的TIRF掃描儀具有額外的優(yōu)勢(shì)。 如前所述，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行精確識(shí)別，激光位置（或掃描儀的位置）內(nèi)部全反射發(fā)生，反之亦然，這是不是這樣。 發(fā)生全內(nèi)反射的確切位置的知識(shí)，沒(méi)有可以用來(lái)照明樣品，在一個(gè)特殊的所謂的HILO模式。如果激光遇到玻璃/水界面在低于所需的全內(nèi)反射的臨界角的角度，激光束將通過(guò)試樣傾斜。 因此，只有部分的試樣所遇到的激光束，并只在本卷中被激發(fā)的熒光團(tuán)。 這將導(dǎo)致在具有低背景和一個(gè)很好的信號(hào) - 噪聲比傳統(tǒng)的落射熒光圖像的圖像。 這種方法的一個(gè)額外的好處，漂白和光毒性大大降低，延長(zhǎng)細(xì)胞生存力，尤其是在長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)。 的的HILO模式是特別適合用于定量研究的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)，分布或相互作用的分子和單分子跟蹤。 一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用程序是泡跟蹤。
在耦合位置可自由定義的一個(gè)全內(nèi)反射熒光掃描儀的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以選擇的激光遇到玻璃/水界面的方向（所謂的方位）。 這意味著，可以選擇的倏逝波的波陣面的方向。 這反過(guò)來(lái)的倏逝波（水平或垂直玻璃/水界面）的傳播方向上有一定的影響。 的傳播方向反過(guò)來(lái)可以影響熒光團(tuán)激發(fā)的效率，因?yàn)樗鼈兺ǔ＞哂幸欢ㄈ∠虻呐紭O子。 徠卡TIRF系統(tǒng)是可能的四個(gè)方位位置之間進(jìn)行選擇，以確保*佳的熒光激發(fā)。
一個(gè)聲光可調(diào)諧濾波器（AOTF）和多模激光光纖保證*快波長(zhǎng)切換和均勻的照明系統(tǒng)的全內(nèi)反射熒光字段
徠卡TIRF自動(dòng)對(duì)準(zhǔn)的好處是*明顯的多色全內(nèi)反射熒光顯微鏡在時(shí)間推移應(yīng)用。 為了這個(gè)目的，不同的激光線之間快速切換是強(qiáng)制的。 這是通過(guò)采用聲光可調(diào)諧濾波器，用于選擇所需的激光線，而不是一個(gè)過(guò)濾系統(tǒng)。 的AOTF能在幾微秒內(nèi)振動(dòng)的方式，基于過(guò)濾器的系統(tǒng)相比，減少傳輸損耗的波長(zhǎng)之間的切換。 一個(gè)AOTF也可調(diào)諧的激光束的強(qiáng)度通過(guò)。 此外，百葉窗AOTF變得過(guò)時(shí)，這也加快了激光線之間的切換。
*好的可能的全內(nèi)反射熒光顯微鏡的另一個(gè)因素是一個(gè)均勻的照明系統(tǒng)的視場(chǎng)。 對(duì)于激光為基礎(chǔ)的全內(nèi)反射熒光顯微鏡，這是強(qiáng)烈地依賴于系統(tǒng)中所使用的特定的激光光纖。 通過(guò)采用多模的激光纖維，具有極高的數(shù)值孔徑，如在Leica TIRF系統(tǒng)的使用，可以實(shí)現(xiàn)*好的均勻性。
圖 圖4a：廣角乳腺癌腫瘤細(xì)胞表達(dá)的GFP標(biāo)記的細(xì)胞粘附分子在細(xì)胞膜上表達(dá)的CD44的熒光圖像。
圖 4B：相同的細(xì)胞在TIRF成像。 禮貌，CNIO瑪麗亞C.蒙托亞博士，西班牙國(guó)家癌癥中心，馬德里，西班牙
