尼康顯微鏡熒光蛋白簡(jiǎn)介
*終在20世紀(jì)60年代初發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白在細(xì)胞生物學(xué)預(yù)示著一個(gè)新的時(shí)代，使調(diào)查人員運(yùn)用分子克隆方法，融合多種蛋白質(zhì)和酶的目標(biāo)熒光團(tuán)部分，以在生物系統(tǒng)中監(jiān)控細(xì)胞過程用光學(xué)顯微鏡和相關(guān)的方法。 當(dāng)加上廣角熒光和共聚焦顯微鏡*近的技術(shù)進(jìn)步，包括*快的低光數(shù)碼相機(jī)和激光控制系統(tǒng)multitracking，綠色熒光蛋白，它的顏色轉(zhuǎn)移的遺傳衍生工具已在成千上萬(wàn)的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)展示了寶貴的服務(wù)。
下村修和弗蘭克·約翰遜，在星期五港實(shí)驗(yàn)室在華盛頓大學(xué)工作，1961年首次分離出一種鈣依賴性的，他們命名水母Aequorea victoria的水母生物發(fā)光蛋白。 在分離過程中，第二缺乏的藍(lán)色發(fā)光生物發(fā)光水母，但用紫外光照射時(shí)能產(chǎn)生綠色熒光蛋白觀察。 由于這個(gè)屬性，該蛋白*終粗魯?shù)拿置?strong style="font-size: 14px">綠色熒光蛋白（GFP）。 在接下來(lái)的二十年里，研究人員確定了水母綠色熒光蛋白一起工作的水母的發(fā)光器官鈣誘導(dǎo)發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)換成綠色熒光特性的品種。
雖然在1992年*只克隆綠色熒光蛋白基因，分子探針的重大潛力沒有實(shí)現(xiàn)，直到若干年后，當(dāng)融合的產(chǎn)品被用于跟蹤細(xì)菌和線蟲的基因表達(dá)。 由于這些早期的研究中，經(jīng)過精心設(shè)計(jì)，產(chǎn)生大量各種顏色的突變體，融合蛋白，生物傳感器，被廣泛稱為熒光蛋白綠色熒光蛋白。 *近，來(lái)自其他物種的熒光蛋白已被識(shí)別和分離，從而進(jìn)一步擴(kuò)大的調(diào)色板。 隨著熒光蛋白技術(shù)的迅速發(fā)展，該實(shí)用程序的廣泛的應(yīng)用*越了簡(jiǎn)單的跟蹤標(biāo)記生物分子在活細(xì)胞中的這種基因編碼的熒光現(xiàn)在變得完全理解。
圖1中所示的兩個(gè)例子，在活細(xì)胞的融合產(chǎn)物，亞細(xì)胞（細(xì)胞器）的位置針對(duì)多個(gè)熒光蛋白標(biāo)記。 負(fù)鼠腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（OK線），在圖1（a）轉(zhuǎn)染熒光蛋白變種雞尾酒融合肽信號(hào)介導(dǎo)運(yùn)輸?shù)暮耍ㄔ鰪?qiáng)型青色熒光蛋白ECFP），線粒體（DsRed熒光蛋白; DsRed2FP），或微管網(wǎng)（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白， 綠色熒光蛋白 ）。 人宮頸腺癌上皮細(xì)胞（HeLa細(xì)胞線）組成的類似的試樣是描繪在圖1（b）。 青色（mTurquoise）和黃色熒光蛋白編碼序列（高爾基復(fù)合體和細(xì)胞核，分別），以及“水果”蛋白質(zhì)，mCherry（mVenus）融合的亞細(xì)胞定位載體共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，目標(biāo)線粒體網(wǎng)絡(luò)。
藍(lán)色，青色和黃色熒光蛋白，綠色熒光蛋白，其突變的等位基因形式，用于構(gòu)造可以表示活細(xì)胞，組織，整個(gè)生物體，與工程的載體轉(zhuǎn)染后的熒光嵌合蛋白質(zhì)。 其他種類，包括珊瑚生物，已分離出紅色熒光蛋白，同樣是有用的。 熒光蛋白技術(shù)避免了凈化裝置的問題的，標(biāo)記，并引入到表面或內(nèi)部抗原產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞或任務(wù)的被標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
維多利亞水母的綠色熒光蛋白的性質(zhì)和修改
綠色熒光蛋白欣賞其中*重要的方面是，在整個(gè)27千道爾頓的天然肽結(jié)構(gòu)是必不可少的開發(fā)和維護(hù)其熒光。 值得注意的是，原則上熒光基團(tuán)是來(lái)自相鄰的三個(gè)一組的氨基酸：絲氨酸，酪氨酸，甘氨酸殘基，在位置65，66，和67（以下簡(jiǎn)稱為Ser65，Tyr66，Gly67，參見圖2）。 雖然這種簡(jiǎn)單的氨基酸基序在整個(gè)自然界中發(fā)現(xiàn)的常見，它一般不導(dǎo)致熒光。 這是**的熒光蛋白的這種肽的三重峰的位置位于中心的是一個(gè)穩(wěn)定的桶11β-折疊片折疊成管狀結(jié)構(gòu)組成的。
的綠色熒光蛋白在中心內(nèi)的疏水環(huán)境中，會(huì)發(fā)生反應(yīng)在Ser65和Gly67的氨基氮原子的羰基上的碳原子之間形成咪唑啉-5 - 酮的含氮雜環(huán)的環(huán)體系的結(jié)果（如在圖2中示出）。 在咪唑啉環(huán)的共軛與Tyr66和成熟的熒光物種的進(jìn)一步氧化結(jié)果。 重要的是要注意的是本機(jī)的綠色熒光蛋白的熒光基團(tuán)存在于兩種狀態(tài)。 質(zhì)子化的形式，主要的狀態(tài)，在395納米，*大激發(fā)和一個(gè)普遍的，非質(zhì)子化的形式，吸收約475納米。 然而，無(wú)論在激發(fā)波長(zhǎng)，熒光發(fā)射波長(zhǎng)在507納米的*大峰值，雖然峰值是廣泛的，并沒有很好地定義。
兩個(gè)主要功能的熒光蛋白的熒光作為探針，其效用具有重要的意義。 首先，作為熒光綠色熒光蛋白的光物理性質(zhì)是相當(dāng)復(fù)雜的，因此，這種分子可容納相當(dāng)數(shù)量的修改。 許多研究都集中在微調(diào)固有綠色熒光蛋白的熒光分子探針提供了廣闊的范圍，但更重要的潛力和廣闊的用人為原料構(gòu)建*熒光蛋白質(zhì)不能被低估。 綠色熒光蛋白的第二個(gè)重要特征是，熒光是高度依賴于周圍的三肽的熒光基團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)。
破壞熒光綠色熒光蛋白變性，可以預(yù)料，周圍的三肽熒光殘留的突變可以顯著地改變熒光性質(zhì)。 的氨基酸殘基的 β桶內(nèi)部的填充物是極其穩(wěn)定的，這會(huì)導(dǎo)致一個(gè)非常高的熒光量子產(chǎn)率（高達(dá)80％）。 這種緊密的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也賦予抗熒光的變化，由于pH值，溫度，和變性劑如尿素波動(dòng)。 高度穩(wěn)定的綠色熒光蛋白的突變，一般以一種消極的方式改變擾動(dòng)，從而導(dǎo)致熒光量子產(chǎn)率和更大的環(huán)境敏感性減少。 盡管有幾個(gè)額外的突變，可以克服這些缺陷，衍生熒光蛋白通常是更敏感的環(huán)境比原生的物種。 遺傳變異與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，這些限制應(yīng)該認(rèn)真考慮。
為了適應(yīng)在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中使用的熒光蛋白，進(jìn)行了野生型綠色熒光蛋白的一些基本的修改，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在所有常用的變種。 *個(gè)步驟是一個(gè)37度環(huán)境優(yōu)化成熟的熒光。 成熟的野生型熒光團(tuán)在28度是相當(dāng)有效的，但將溫度提高到37度，大大降低了整體的成熟和熒光下降的結(jié)果。 亮氨酸導(dǎo)致改進(jìn)的熒光的成熟，在37度，這是在28度觀察至少相當(dāng)于64位的苯丙氨酸殘基（Phe64）突變。 這種突變是本來(lái)自Aequorea victoria的熒光蛋白在*流行 的品種，但并不是*的突變，提高其他變體已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在37度折疊。
除了改善在37度的成熟，也改善了優(yōu)化的密碼子使用的哺乳動(dòng)物表達(dá)綠色熒光蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的整體亮度。 *過190個(gè)沉默突變，已被導(dǎo)入的編碼序列在人體組織中表達(dá)增強(qiáng)。甲Kozak的翻譯起始位點(diǎn)（含有的堿基序列A / GCCAT）也被引入第二個(gè)氨基酸為纈氨酸插入。 這些，以及與各種其他改進(jìn)（下面討論），導(dǎo)致在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的活細(xì)胞成像的一個(gè)非常有用的探針，共同所有目前使用的是來(lái)自于原來(lái)的水母蛋白的熒光探針。
熒光蛋白調(diào)色板
范圍廣泛的熒光蛋白基因的遺傳變異已開發(fā)出功能熒光光譜幾乎跨越了整個(gè)可見光光譜（見表1）。 原Aequorea victoria的水母綠色熒光蛋白的誘變努力導(dǎo)致在新的熒光探針，該范圍的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，有一些體內(nèi)報(bào)告分子在生物學(xué)研究中*廣泛使用的。 更長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光蛋白，散發(fā)橙色和紅色光譜區(qū)域，已開發(fā)海洋?？?em>芨Discosoma，和珊瑚屬于類珊瑚蟲 。 還有其他物種已被開采產(chǎn)生類似的蛋白質(zhì)，有青色，綠色，黃色，橙色和深紅色熒光。 發(fā)展的研究工作是不斷提升的亮度和穩(wěn)定的熒光蛋白，從而提高他們的整體實(shí)用性。
熒光蛋白特性
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表1
表1給出的是一個(gè)匯編顯示一些*流行和*有用的熒光蛋白變種物業(yè)。 隨著每個(gè)熒光蛋白質(zhì)的通用名稱和/或首字母縮寫，峰值吸收和發(fā)射波長(zhǎng)（納米），摩爾消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，相對(duì)亮度，和在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)協(xié)會(huì)被列出。 是來(lái)自于該產(chǎn)品的摩爾消光系數(shù)和量子產(chǎn)率，EGFP的值除以計(jì)算出的亮度值。 創(chuàng)建此房產(chǎn)已被科學(xué)和商業(yè)的文獻(xiàn)資源，目的不是要全面，而是代表熒光蛋白的衍生物，在文獻(xiàn)中得到相當(dāng)?shù)闹匾?，可能證明是有價(jià)值的研究工作。 此外，在受控條件下的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜中列出的表和圖所示的記錄，可進(jìn)行歸一比較和顯示之用。 以實(shí)際的熒光顯微鏡調(diào)查，光譜和波長(zhǎng)極大可能會(huì)發(fā)生變化，由于對(duì)環(huán)境的影響，如pH，離子濃度，溶劑的極性，以及局部探針濃度的波動(dòng)。 因此，以下列表中的消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率可能會(huì)有所不同，在實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)際觀察到的。
綠色熒光蛋白
雖然本機(jī)產(chǎn)生顯著的綠色熒光蛋白的熒光和極其穩(wěn)定，紫外線范圍內(nèi)的*大值是在關(guān)閉激發(fā)。由于紫外線燈需要特殊的光學(xué)考慮，可能會(huì)損壞的活細(xì)胞，它通常不是非常適合于用光學(xué)顯微鏡的活細(xì)胞成像。 幸運(yùn)的是，的*大激發(fā)的綠色熒光蛋白很容易轉(zhuǎn)移到488納米（青色區(qū)域）通過引入單點(diǎn)突變改變成65位的絲氨酸蘇氨酸殘基（S65T）。 這種突變的特點(diǎn)是在*流行 的綠色熒光蛋白的變種，稱為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP），這是在廣泛市售BD Biosciences公司Clontech的熒光蛋白技術(shù)的領(lǐng)導(dǎo)者，所提供的載體。 此外，增強(qiáng)版可以使用常用的過濾器組設(shè)計(jì)用于熒光成像，并且是其中*亮的當(dāng)前可用的熒光蛋白。 這些功能提供了增強(qiáng)的綠色熒光蛋白的一個(gè)*流行的探針和單標(biāo)簽熒光蛋白實(shí)驗(yàn)的*佳選擇。 EGFP使用*的缺點(diǎn)是輕微的敏感性pH值和弱的二聚化的傾向。
除了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，其他幾個(gè)變種目前正在使用活細(xì)胞成像。 這些*好的光穩(wěn)定性和亮度方面之一可能是翡翠的變種，但缺乏商業(yè)源限制了其使用。 幾個(gè)消息來(lái)源提供了人性化的綠色熒光蛋白的變種，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）實(shí)驗(yàn)中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。 苯丙氨酸殘基在位置64亮氨酸（F64L GFP2）的換人產(chǎn)生一個(gè)突變，保留了400納米的激發(fā)峰，并且可以加上增強(qiáng)的黃色熒光蛋白作為一種有效的伙伴。 S65C突變（通常代半胱氨酸絲氨酸）的激發(fā)峰在474納米的一個(gè)變種已經(jīng)******一個(gè)更合適的商業(yè)合作伙伴FRET增強(qiáng)藍(lán)色熒光蛋白質(zhì)比紅移增強(qiáng)綠色版。 *后，一個(gè)礁珊瑚的蛋白，被稱為ZsGreen1具有發(fā)光峰在505納米，已被引入作為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的替代品。 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，ZsGreen1相對(duì)EGFP是非常光明的，但效用有限生產(chǎn)融合突變，類似到其他礁珊瑚的蛋白質(zhì)，有一種傾向，形成四聚體。
黃色熒光蛋白
黃色熒光蛋白家族的啟動(dòng)后，綠色熒光蛋白的晶體結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸殘基203（Thr203）附近的生色。 本酪氨酸殘基的突變引入穩(wěn)定的發(fā)色基團(tuán)的激發(fā)態(tài)偶極矩導(dǎo)致20納米移位至較長(zhǎng)的波長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射光譜。 精煉導(dǎo)致增強(qiáng)的黃色熒光蛋白（EYFP），這是一個(gè)*亮的和*廣泛使用的熒光蛋白的發(fā)展。 增強(qiáng)型黃色熒光蛋白的熒光發(fā)射光譜的亮度和一個(gè)出色的候選人的多色成像實(shí)驗(yàn)在熒光顯微鏡相結(jié)合，使這種探頭。 增強(qiáng)型青色熒光蛋白（ECFP）或GFP2搭配時(shí)，增強(qiáng)型黃色熒光蛋白也是有用的能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。 然而，黃色熒光蛋白提出了一些問題，這是很敏感的酸性pH和失去其熒光的大約50％的在pH 6.5。 此外，EYFP也被證明是氯離子和光漂白敏感，更容易比綠色熒光蛋白的。
黃色探頭發(fā)射黃色熒光蛋白結(jié)構(gòu)的持續(xù)發(fā)展已經(jīng)解決了一些問題。 黃水晶的變種黃色熒光蛋白EYFP相對(duì)是非常光明的，并已被證明是更耐漂白，酸性pH值等環(huán)境影響。 另一個(gè)衍生物，命名為金星 ，是*快的成熟和開發(fā)的亮黃色的變種之一。 珊瑚蛋白ZsYellow1，*初是從一個(gè)Zoanthus種原產(chǎn)于印度洋和太平洋的克隆，產(chǎn)生真正的黃色發(fā)射多色應(yīng)用的理想選擇。 衍生像ZsGreen1，這是不是有用，創(chuàng)建EYFP融合，有一種傾向，形成四聚體。 許多更**的黃色熒光蛋白變體在熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究的定量結(jié)果是重要的，潛在有用的，以及其他調(diào)查。
如圖3中所示，對(duì)于許多常用市售的熒光蛋白，跨越從青色到遠(yuǎn)紅可見光譜的吸收光譜和發(fā)射光譜。 來(lái)自Aequorea victoria的水母的變體，包括增強(qiáng)的青色，綠色，和黃色熒光蛋白，表現(xiàn)出峰值發(fā)射波長(zhǎng)范圍從425至525納米。 來(lái)自珊瑚礁，DsRed2 HcRed1（見下文）的熒光蛋白，發(fā)出波長(zhǎng)較長(zhǎng)，但遭受從齊聚文物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。
藍(lán)色和青色熒光蛋白
的藍(lán)色和青色的綠色熒光蛋白變體由于在本機(jī)的熒光基團(tuán)（參見圖2）的第66位（Tyr66）的酪氨酸殘基直接修改。 該氨基酸組氨酸的查詢結(jié)果在藍(lán)色發(fā)射具有在450納米波長(zhǎng)的極大值的轉(zhuǎn)換，而轉(zhuǎn)換為色胺的查詢結(jié)果中的一大約480納米的熒光峰隨著肩膀，大約500納米的峰值。 這兩個(gè)探頭只有弱熒光，需要增加二次突變折疊效率和整體亮度。 即使經(jīng)過修改，這一類熒光蛋白（EBFP和ECFP）的增強(qiáng)版本，只有約25％至40％，亮如增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。此外，藍(lán)色和青色熒光蛋白的激發(fā)是不常用的，所以專門的過濾器組和激光源的光譜區(qū)域中*有效的。
盡管缺點(diǎn)，藍(lán)色和青色熒光蛋白，多色標(biāo)記的廣泛興趣和FRET推廣他們的應(yīng)用程序在多個(gè)調(diào)查。 增強(qiáng)型青色熒光蛋白，可興奮離峰的氬離子激光（使用457納米的譜線），是顯著更耐漂白比藍(lán)衍生物，這是特別真實(shí)。 對(duì)比其他熒光蛋白，有沒有高水平的興趣，為設(shè)計(jì)更好的探針的可見光光譜中的藍(lán)色區(qū)域，發(fā)展研究的大多數(shù)在這個(gè)類熒光團(tuán)一直專注于青色的變種。
其中改進(jìn)青色熒光蛋白相繼******，AmCyan1和增強(qiáng)的青色變種稱為天藍(lán)顯示*有希望。 派生礁珊瑚，Anemonia majano的 ，AmCyan1熒光蛋白變體已經(jīng)與人的密碼子優(yōu)化，以產(chǎn)生一個(gè)相對(duì)高的亮度水平和抗光漂白相比，增強(qiáng)型青色熒光蛋白在哺乳動(dòng)物表達(dá)。 在下行路上，類似于大多數(shù)其他礁珊瑚的蛋白質(zhì)，這種探頭有一種傾向，形成四聚體。 天藍(lán)熒光探針是由增強(qiáng)型青色熒光蛋白的位點(diǎn)定向誘變，以產(chǎn)生較高的消光系數(shù)和改進(jìn)的量子產(chǎn)率。 西魯林是至少2倍的亮度比增強(qiáng)型青色熒光蛋白，并已被證明加上黃色發(fā)射熒光的蛋白質(zhì)，如金星（參見圖4）時(shí)，顯著增加了信號(hào) - 噪聲比，在FRET調(diào)查。
紅色熒光蛋白
熒光蛋白開發(fā)的主要目標(biāo)已經(jīng)成為一個(gè)紅色發(fā)光衍生物等于或*過*的性能增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的建設(shè)。 在一個(gè)合適的紅色熒光蛋白的優(yōu)點(diǎn)是潛在的兼容性與現(xiàn)有的共焦和廣角顯微鏡（和他們的過濾器設(shè)置），以及增加容量圖像整個(gè)動(dòng)物，這是明顯更加透明紅燈。 由于施工從Aequorea victoria的水母綠色熒光蛋白的黃色光譜區(qū)以外的紅移突變已被證明基本上是不成功的，調(diào)查人員已經(jīng)把他們的搜索熱帶珊瑚。
Discosoma芨來(lái)自*的珊瑚源性熒光蛋白被廣泛地利用，并通常被稱為DsRed的 。 一旦完全成熟，紅色熒光蛋白的功能而有一個(gè)主要的激發(fā)光譜的峰值在558納米和500納米左右的小峰，峰值在583毫微米的熒光發(fā)射光譜。 幾個(gè)問題都與使用DsRed的，但是。 成熟的紅色熒光蛋白的熒光發(fā)生緩慢和收益熒光發(fā)射是在綠色區(qū)域時(shí)，通過一個(gè)時(shí)間段。 被稱為綠色的狀態(tài) ，與其他綠色熒光蛋白，因?yàn)楣庾V重疊的多個(gè)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了這件神器問題。 此外，紅色熒光蛋白是一種專四聚體，可以形成較大的蛋白質(zhì)聚集體的活細(xì)胞。 雖然這些功能是無(wú)關(guān)緊要的DsRed的使用作為記者的基因表達(dá)，DsRed的表位標(biāo)簽的有用性受到嚴(yán)重限制。 相反水母的熒光蛋白質(zhì)，已成功地用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的數(shù)百個(gè)，紅色熒光蛋白共軛物已被證明不太成功，通常是有毒的。
有幾個(gè)問題與紅色熒光蛋白的熒光蛋白已被克服，通過誘變。 第二代的紅色熒光蛋白，稱為DsRed2，包含在該肽的氨基末端，防止蛋白質(zhì)聚集體的形成，并降低毒性的幾個(gè)突變。 此外，熒光基團(tuán)的成熟時(shí)間減少這些修改。 DsRed2蛋白形成的四聚體，但它是更兼容的綠色熒光蛋白在多個(gè)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，由于更快的成熟。 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步減少成熟時(shí)間與紅色熒光蛋白的突變體，這也顯示增加的亮度電平在峰值細(xì)胞熒光的第三代。 紅色熒光表達(dá)后一個(gè)小時(shí)內(nèi)，可以觀察到紅色熒光蛋白快速相比，約6個(gè)小時(shí)DsRed2和11小時(shí)紅色熒光蛋白。 稱為紅星酵母優(yōu)化變型中，已經(jīng)開發(fā)出來(lái)，還具有改進(jìn)的成熟率，并增加亮度。紅色熒光蛋白-Express和紅星綠色狀態(tài)的存在是看不出來(lái)的，這些熒光蛋白呈現(xiàn)橙紅色光譜區(qū)域多重標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中的*佳選擇。因?yàn)檫@些探頭仍然預(yù)留四聚體，他們沒有標(biāo)記蛋白的*佳選擇。
礁珊瑚生物體已分離出了幾個(gè)附加的紅色熒光蛋白，示出了相當(dāng)多的承諾。適于哺乳動(dòng)物應(yīng)用的*HcRed1分離從皺Heteractis，現(xiàn)在是商業(yè)可用。HcRed1*初源自非熒光的吸收紅光的色蛋白，通過誘變，以產(chǎn)生弱熒光的的預(yù)留二聚體具有*大吸收波長(zhǎng)為588納米和618納米的*大發(fā)射。雖然這種蛋白的熒光發(fā)射光譜從紅色熒光蛋白的分離是足夠的，它往往協(xié)合的紅色熒光蛋白和少得多明亮。一個(gè)有趣的HcRed構(gòu)建含有兩個(gè)分子串聯(lián)已產(chǎn)生克服，在原則上，優(yōu)先發(fā)生于串聯(lián)配對(duì)產(chǎn)生標(biāo)簽的單體的二聚化。然而，由于這種雙蛋白的整體亮度尚未改善，這是不是一個(gè)好的選擇為常規(guī)應(yīng)用在活細(xì)胞顯微鏡。
發(fā)展單體熒光蛋白變種
在其自然狀態(tài)，存在大多數(shù)熒光蛋白，二聚體，四聚體，或高階低聚物。同樣，Aequorea victoria的綠色熒光蛋白被認(rèn)為參與在一個(gè)四聚體復(fù)合物與水母發(fā)光蛋白，但這種現(xiàn)象已經(jīng)在非常高的蛋白濃度和水母的熒光蛋白的二聚化的傾向，只觀察到通常是非常弱（具有解離常數(shù)大于100微摩爾）。熒光蛋白的二聚化，因而一般不被觀察到，當(dāng)它們被表達(dá)在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)。然而，當(dāng)熒光蛋白定位到特定的細(xì)胞區(qū)室，如質(zhì)膜，本地化的蛋白質(zhì)濃度理論上可以變得足夠高，以允許二聚化。這是一個(gè)特別值得關(guān)注的，在進(jìn)行FRET實(shí)驗(yàn)，它可以產(chǎn)生復(fù)雜的數(shù)據(jù)集二聚文物，很容易受到損害。
建設(shè)的單體紅色熒光蛋白變體已被證明是一項(xiàng)困難的任務(wù)。*代單體紅色熒光蛋白（稱為RFP1）的創(chuàng)造需要*過30個(gè)氨基酸改變結(jié)構(gòu)。然而，該衍生物具有顯著降低的熒光發(fā)射的天然蛋白質(zhì)和光漂白相比非常快，渲染不太有用的單體綠色和黃色熒光蛋白。突變的研究工作，包括新技術(shù)，如體細(xì)胞突變，將繼續(xù)在搜索黃色，橙色，紅色和深紅色熒光蛋白的變種，進(jìn)一步降低的傾向，這些潛在有效的生物探針自聯(lián)營(yíng)公司的同時(shí)推動(dòng)*大發(fā)射朝更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。
改進(jìn)的單體熒光蛋白正在開發(fā)，增加了消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，耐光性，雖然沒有一個(gè)單一的變種尚未優(yōu)化的所有標(biāo)準(zhǔn)。此外，與專四聚體的紅色熒光蛋白的表達(dá)問題被克服生成單體的變種的努力，已經(jīng)取得了的衍生物，更兼容的生物學(xué)功能。
也許在這方面一直是*壯觀的發(fā)展引進(jìn)新的收獲來(lái)自單體紅色熒光蛋白，通過定向誘變定位的Q66和Y67殘留的熒光蛋白。反映類似顏色的熒光發(fā)射光譜輪廓（見表1和圖5）水果命名，這支隊(duì)伍的單體熒光蛋白表現(xiàn)出極大值在560至610納米的波長(zhǎng)范圍。通過反復(fù)的體細(xì)胞突變產(chǎn)生進(jìn)一步擴(kuò)展這個(gè)類熒光蛋白質(zhì)發(fā)射波長(zhǎng)650納米。這些新的蛋白質(zhì)基本上填補(bǔ)之間的差距*紅移水母熒光蛋白（如金星），珊瑚紅色熒光蛋白。雖然這些新的熒光蛋白質(zhì)缺乏必要的亮度和穩(wěn)定性，許多成像實(shí)驗(yàn)，它們的存在是令人鼓舞的，因?yàn)樗砻鞑粶y(cè)明亮，穩(wěn)定，單體熒光蛋白在整個(gè)可見光譜。
光學(xué)熒光筆
在熒光蛋白研究中*有趣的發(fā)展之一，一直是應(yīng)用這些探針分子或光熒光筆（見表2），它的結(jié)果的外部的光子刺激或時(shí)間的推移改變顏色或排放強(qiáng)度。作為一個(gè)例子，本機(jī)水母肽的單點(diǎn)突變創(chuàng)建一個(gè)綠色熒光蛋白（被稱為PA-GFP），使從紫外到藍(lán)色光轉(zhuǎn)化的激發(fā)峰在400納米范圍內(nèi)的光被照明的光活化的版本。未轉(zhuǎn)化的PA-GFP具有相似的配置文件（約395至400納米）與野生型蛋白的激發(fā)峰。激發(fā)峰在488納米光轉(zhuǎn)化后，增加了約100倍。此事件喚起PA-GFP的未轉(zhuǎn)化的和轉(zhuǎn)換池的非常高的對(duì)比度之間的差異，是有用的細(xì)胞內(nèi)的分子亞群的動(dòng)態(tài)跟蹤。圖6所示的（a）是含有PA-GFP的488納米氬離子激光激發(fā)成像前（圖圖6（a））和之后（圖圖6（d））的光轉(zhuǎn)化在細(xì)胞質(zhì)中被轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生活405納米的藍(lán)色激光二極管。
的選擇光學(xué)熒光筆的性質(zhì)
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表2
光學(xué)熒光筆，也可以采用其他熒光蛋白。 三光子激發(fā)（小于760納米），紅色熒光蛋白的熒光蛋白是能夠?qū)⒄５募t色熒光綠色。 這種效應(yīng)可能是由于紅色熒光蛋白，紅色的發(fā)色團(tuán)，從綠色狀態(tài)中觀察到的熒光光漂白選擇性。 定時(shí)器紅色熒光蛋白變種幾個(gè)小時(shí)的過程中逐漸變成明亮的綠色（500納米排放），以鮮紅的（580納米排放）。 綠色到紅色熒光的相對(duì)比例可以被用來(lái)收集用于基因表達(dá)的調(diào)查的時(shí)間數(shù)據(jù)。
被稱為PS-CFP，來(lái)自綠色熒光蛋白變體的誘變，甲光開關(guān)的光學(xué)熒光筆，已觀察到過渡從青色到綠色熒光照明后，在405納米（注意在圖6（b）和6的中央細(xì)胞的光轉(zhuǎn)化（e）條）。 以作為單體時(shí)，該探頭是潛在有用的，在光漂白，光轉(zhuǎn)換和光活化的調(diào)查。 然而，從PS-CFP的熒光是約2.5倍的調(diào)光比PA-GFP和其他方面的光轉(zhuǎn)化效率（熒光發(fā)射的光轉(zhuǎn)化的40納米移位小于觀察到相似的探針）熒光筆差。 熒光蛋白或相關(guān)的其他誘變，得到更有用的變體，在該波長(zhǎng)區(qū)域有可能。
從珊瑚和海葵物種克隆熒光蛋白光學(xué)熒光筆也被開發(fā)楓隔離的石珊瑚，photoconverts從綠色到紅色，在紫外線的存在，一種熒光蛋白。 與PA-GFP，熒光楓轉(zhuǎn)換發(fā)生從它的照明光譜上不同的光的吸收。 不幸的是，這種蛋白是一種專性的四聚體，使得它不太適合毛皮使用作為比PA-GFP的表位標(biāo)簽。 另一個(gè)四聚體石珊瑚（Lobophyllia hemprichii）熒光蛋白的變種，稱為EosFP（見表2），發(fā)出明亮的綠色熒光，用紫外光照射時(shí)，在約390納米的橙紅色。 在這種情況下，光譜的移位所產(chǎn)生的光引起的變形例，相鄰的發(fā)色基團(tuán)的肽主鏈中包含一個(gè)停頓。進(jìn)一步誘變的“野生型”EosFP蛋白產(chǎn)生單體的衍生物，這可能是有用的構(gòu)建融合蛋白。
第三非水母光熒光筆， 點(diǎn)燃熒光蛋白（KFP1）的已開發(fā)非熒光生色分離Anemonia蘇卡達(dá)，現(xiàn)在市售（Evrogen）。 點(diǎn)燃熒光蛋白不會(huì)出現(xiàn)排放，直到照亮綠燈。 在一個(gè)短暫的紅色熒光的低強(qiáng)度的光的結(jié)果，*過了幾分鐘的衰減（參見圖6（c）中的線粒體）。 照明用藍(lán)色光線立即點(diǎn)燃的熒光淬滅，允許嚴(yán)格控制熒光標(biāo)記。 與此相反，高強(qiáng)度的照明導(dǎo)致不可逆的火種，并允許穩(wěn)定的高亮顯示類似的PA-GFP（圖6（f）條）。 在擁擠的環(huán)境中追蹤粒子的運(yùn)動(dòng)時(shí)，能夠精確地控制熒光格外有用。 例如，這種方法已經(jīng)成功用于跟蹤開發(fā)爪蟾胚胎和個(gè)人PC12細(xì)胞中線粒體的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)板細(xì)胞的命運(yùn)。
由于光學(xué)熒光筆繼續(xù)發(fā)展，熒光蛋白，可用于光學(xué)標(biāo)記應(yīng)走向光明的發(fā)展，單體，可以很容易光轉(zhuǎn)換和顏色的發(fā)射，顯示了廣泛的變種。 加上這些進(jìn)步，顯微鏡在細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，配備照明熒光觀察模式和區(qū)域標(biāo)記之間的順利協(xié)調(diào)將變得司空見慣。 *終，這些創(chuàng)新有潛力做出顯著成績(jī)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在空間和時(shí)間上的動(dòng)態(tài)。
熒光蛋白載體和基因轉(zhuǎn)移
熒光蛋白是相當(dāng)靈活的，并已成功地應(yīng)用在幾乎每一個(gè)生物學(xué)科從微生物系統(tǒng)生理學(xué)。 用于基因表達(dá)研究，在培養(yǎng)的細(xì)胞和組織，以及活的動(dòng)物，這些隨處可見的探針作為記者，是極其有用的。 熒光蛋白在活細(xì)胞中，*常用的蛋白質(zhì)，細(xì)胞器，和其他細(xì)胞區(qū)室的定位和動(dòng)態(tài)跟蹤。 已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)，構(gòu)建熒光蛋白融合的產(chǎn)品和增強(qiáng)其表達(dá)在哺乳動(dòng)物和其他系統(tǒng)中。 主要車輛引入到細(xì)胞中的熒光蛋白嵌合基因序列是基因工程細(xì)菌的質(zhì)粒和病毒載體。
熒光蛋白基因的融合產(chǎn)物，可以被引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞和其他細(xì)胞，使用適當(dāng)?shù)妮d體（通常是質(zhì)粒或病毒）或瞬時(shí)或穩(wěn)定。 在短暫的，或暫時(shí)的，基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（通常稱為“ 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染），質(zhì)?；虿《綝NA導(dǎo)入宿主生物體不一定整合到染色體，但可以在很短的一段時(shí)間內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。 表達(dá)的基因的融合產(chǎn)物，容易使用一個(gè)過濾器組兼容的熒光蛋白質(zhì)的熒光觀察監(jiān)測(cè)中，通常會(huì)發(fā)生在一段轉(zhuǎn)染后的幾個(gè)小時(shí)，持續(xù)72至96小時(shí)后的質(zhì)粒DNA引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 在許多情況下，質(zhì)粒DNA可以被整合到基因組在一個(gè)永久的狀態(tài)，以形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。 瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的選擇取決于調(diào)查的目標(biāo)。
有用的熒光蛋白基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的基本的質(zhì)粒載體配置有一些必要的組件。 必須包含該質(zhì)粒的原核細(xì)菌的DNA復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因的核苷酸序列編碼。 這些元素，通常被稱為班車序列，允許進(jìn)行傳播和選擇的質(zhì)粒哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染的載體，以產(chǎn)生足夠數(shù)量的細(xì)菌宿主內(nèi)。 此外，該質(zhì)粒必須包含一個(gè)或多個(gè)控制開始信使RNA的轉(zhuǎn)錄，哺乳動(dòng)物的多聚腺苷酸化信號(hào)，一個(gè)內(nèi)含子（可選），和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因的共同選擇的真核細(xì)胞的遺傳元件。 轉(zhuǎn)錄元件是必要的哺乳動(dòng)物宿主，表達(dá)感興趣的基因融合產(chǎn)物，并選擇基因通常是一種抗生素，含有質(zhì)粒的細(xì)胞賦予阻力。 這些一般功能根據(jù)質(zhì)粒的設(shè)計(jì)而有所不同，和許多載體有廣泛的適合于特定的應(yīng)用程序的附加組件。
成功的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)依賴于使用的高品質(zhì)的質(zhì)?；虿《綝NA載體，是相對(duì)自由的細(xì)菌內(nèi)毒素。在原生狀態(tài)，環(huán)狀質(zhì)粒DNA分子表現(xiàn)出三級(jí)*螺旋構(gòu)象扭曲周圍的雙螺旋結(jié)構(gòu)本身幾次。很多年了，*螺旋質(zhì)粒和病毒DNA純化方法的選擇是在插層劑（如溴化3,8 -二氨基-5 -乙基-6 -苯基菲啶溴化或碘化丙啶等）的存在下氯化銫密度梯度離心法。該技術(shù)中，這是昂貴的設(shè)備和材料，偏析從線性染色體和缺口的環(huán)狀DNA*螺旋的DNA（質(zhì)粒）根據(jù)浮力密度，使收集的高純度質(zhì)粒DNA。*近的，簡(jiǎn)化的離子交換柱色譜法（通常被稱為一個(gè)小量制備）在很大程度上取代了繁瑣和耗時(shí)的離心協(xié)議在一個(gè)相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA。
已經(jīng)開發(fā)了專門的細(xì)菌突變體，被稱為主管細(xì)胞，為方便和相對(duì)廉價(jià)的擴(kuò)增的質(zhì)粒載體。該細(xì)菌含有調(diào)色板的突變，使他們特別容易受到質(zhì)粒復(fù)制，并且已經(jīng)在一個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)化穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的DNA的化學(xué)通透。改造后的細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的存在的選擇取決于質(zhì)粒的抗生素。細(xì)菌培養(yǎng)，離心濃縮和裂解用堿性洗滌劑溶液中含有的酶降解污染的RNA干擾。的溶胞產(chǎn)物，然后過濾，并放置在離子交換柱。不需要的物質(zhì)，包括RNA，DNA，蛋白質(zhì)，從柱中徹底洗滌前使用高鹽緩沖液中洗脫的質(zhì)粒DNA。醇（異丙醇）沉淀濃縮物，這是通過離心收集，洗滌，并再溶解在緩沖液中的洗脫質(zhì)粒DNA。純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)上班做好準(zhǔn)備。
用于轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞必須是在良好的生理?xiàng)l件下，生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在手術(shù)過程中。寬譜已商業(yè)化開發(fā)的轉(zhuǎn)染試劑，優(yōu)化培養(yǎng)細(xì)胞攝取質(zhì)粒DNA。這些技術(shù)的范圍從簡(jiǎn)單的磷酸鈣沉淀，螯合的質(zhì)粒DNA在脂質(zhì)囊泡，保險(xiǎn)絲細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中提供的內(nèi)容（如圖8所示）。統(tǒng)稱為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，脂質(zhì)為基礎(chǔ)的技術(shù)已經(jīng)滿足了廣泛的接受，因?yàn)樗挠行?，在大量流行的?xì)胞系，它是目前大多數(shù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的*方法。
*后，在熒光蛋白應(yīng)用的巨大潛力，為工程的生物傳感器是剛才被實(shí)現(xiàn)。生物傳感器的構(gòu)造的數(shù)量正在迅速增長(zhǎng)。通過使用結(jié)構(gòu)信息，這些探針的發(fā)展已導(dǎo)致提高了靈敏度，并且將繼續(xù)這樣做。當(dāng)然這些努力的成功表明，幾乎所有的生物的參數(shù)將是可衡量的，使用適當(dāng)?shù)臒晒獾鞍诪榛A(chǔ)的生物傳感器。