徠卡顯微鏡：白光激光器
共聚焦顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的理想光源應(yīng)如何執(zhí)行？ 它應(yīng)具有足夠的強(qiáng)度，可調(diào)諧的顏色同時(shí)激發(fā)的一系列樣品。 此外，它應(yīng)該是一個(gè)脈沖光源壽命熒光實(shí)驗(yàn)。 已經(jīng)發(fā)明這種源：白光激光器。 它由一個(gè)高能量脈沖IR被饋送通過(guò)光子晶體光纖的光纖激光器，產(chǎn)生的光譜的連續(xù)。 小bandlets選自該連續(xù)的聲光可調(diào)諧濾波器的裝置。 該儀器提供足夠激烈，像一個(gè)普通的激光束 - 這是衍射極限照明的要求，可調(diào)焦的光。它允許通過(guò)頻譜從藍(lán)色到紅色的顏色的連續(xù)調(diào)諧。 八并行可調(diào)顏色為標(biāo)準(zhǔn)。 ，它提供了一些額外的好處，這是由于由脈沖的能量發(fā)射。 它本質(zhì)上是一種基于單光子熒光壽命成像源。 并且它允許抑制在檢測(cè)信道的激勵(lì)光通過(guò)玻璃 - 自由電子發(fā)射濾波。
*連續(xù)譜白光光源
古典激光光源通常只提供一個(gè)單一的窄的發(fā)射。 某些氣體激光器可以同時(shí)發(fā)射了幾行。 ***的例子是氬氣體激光器，這可能是有5條線中的藍(lán)綠色的范圍內(nèi)。其他類型的激光器，染料激光器一樣，是可調(diào)諧的，但一次只發(fā)射單一的顏色。此外，染料激光器是非常不穩(wěn)定的，需要一定的耐心才能正常運(yùn)行。 有全固態(tài)激光器是可調(diào)諧的，但僅限于紅外范圍（如鈦薩激光器）。 除了其高復(fù)雜性和昂貴，他們也可以只發(fā)出單一波長(zhǎng)的時(shí)間和調(diào)整過(guò)程是很慢的（多少秒）。
這種情況已經(jīng)完全改變了本發(fā)明，同時(shí)在很寬的范圍內(nèi)發(fā)射的光源，但仍像激光器在可聚焦。
這些源采用了光纖紅外激光發(fā)射光脈沖在大約80兆赫。 這種化合物被用于作為“種子”，即提供了一個(gè)精確的時(shí)鐘，但具有相當(dāng)?shù)偷哪芰俊?/span> 一個(gè)二極管泵浦的激光放大器中放大，其后的脈沖。 放大激光也是基于光纖的，兩個(gè)系統(tǒng)都無(wú)縫耦合光纖熔接。 放大器的輸出可能會(huì)達(dá)到約10 W的紅外光的平均功率，但切碎約脈沖。 200 PS在80 MHz。 這種高能量的脈沖，*后集中在一個(gè)所謂的光子晶體光纖（PCF）的入口表面的。 這些纖維具有在纖維的中心的空心管的圖案的。 強(qiáng)烈的非線性過(guò)程在單色光擴(kuò)散成一種廣譜達(dá)到藍(lán)色或什至紫外線管圖案的表面，導(dǎo)致包括群速度色散（*多4 次 ），自陡，拉曼散射和等離激元的裂變。
根據(jù)不同的PCF的長(zhǎng)度，單色紅外峰頻譜擴(kuò)散到高達(dá)幾百納米。 典型的纖維長(zhǎng)度為0.5至2米。
顏色和強(qiáng)度的兩維聲光調(diào)諧
就像在任何其他的顯微鏡，使用白色熒光照明源，白光激光共聚焦顯微鏡需要一種手段來(lái)選擇顏色，具體地激發(fā)各種熒光染料。 如果可能，多種顏色是非常有用的并行乘法染色樣品的激發(fā)。 在寬視場(chǎng)熒光顯微鏡中，這個(gè)任務(wù)是由激發(fā)光濾光片。 具有3個(gè)或4個(gè)傳輸頻帶dichroitic過(guò)濾器用于多染色樣品。
從*連續(xù)發(fā)射的光束提供一個(gè)更靈活的解決方案。 聲光可調(diào)諧濾波器可以挑選出的頻譜單行（這實(shí)際上是一個(gè)狹窄的扁帶），并轉(zhuǎn)移到一個(gè)不同的方向。 頻譜的其余部分將通過(guò)晶體直行。 由于顏色的扁帶是由機(jī)械激勵(lì)頻率控制的偏轉(zhuǎn)，從輸入頻譜可以選擇任何顏色的無(wú)級(jí)可調(diào)。 該扁帶的寬度是約1 ... 3納米的波長(zhǎng)而定。 這樣的細(xì)帶中的能量是在幾毫瓦，這是足夠遠(yuǎn)成像的和經(jīng)常使用的，即使對(duì)于FRAP實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)。 通過(guò)添加更多的電子驅(qū)動(dòng)器，以產(chǎn)生在晶體中的機(jī)械波，它是可以直接到*為了同時(shí)一系列顏色。 八色同步標(biāo)準(zhǔn)（但不是技術(shù)限制）。 這些bandlets中的每一個(gè)都是可調(diào)諧的波長(zhǎng)和強(qiáng)度。
這種組合使白光激光共聚焦顯微鏡激發(fā)WLL的理想來(lái)源。 它將為所有已知的染料在可見光范圍內(nèi)激發(fā)，它允許記錄激發(fā)光譜探索新染料的光譜特性，尤其是在原位。 和它給自由調(diào)整勵(lì)磁離峰，如果這是需要的發(fā)射收集的原因或提高分離相鄰的染料。
圖 1：左：光子晶體光纖橫截面。 中空管的中心的圖案是復(fù)雜的非線性光子的相互作用空間中產(chǎn)生了廣泛的能量的光子。
右：白色的激光光產(chǎn)生的放大的紅外脈沖激光通過(guò)光子晶體光纖的供給。 PCF是一個(gè)堅(jiān)實(shí)的*連續(xù)譜發(fā)生器。 連續(xù)體的寬度取決于光子晶體光纖的長(zhǎng)度 - 以及許多其他的工程細(xì)節(jié)。 所有零件的基于光纖的固有的免維護(hù)。 通過(guò)棱鏡產(chǎn)生的PCF的出口處的頻譜，并投射到一張紙上。
圖 2：采用的聲光可調(diào)諧濾波器，提取了一系列的各種顏色的bandlets的*連續(xù)譜源的白色發(fā)光。 可調(diào)諧這些bandlets是在顏色和強(qiáng)度。 同時(shí)使用了一些bandlets需要并行乘法染色樣品的激發(fā)。
聲光分束（AOBS）可以做的工作
圖 3：只自由可調(diào)諧分束裝置可有效地作為依賴于波長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射閥，用于當(dāng)使用一個(gè)可調(diào)諧源。 聲光的分束器，可以無(wú)級(jí)調(diào)節(jié)，同時(shí)適應(yīng)任何給定的一系列激勵(lì)顏色。
激勵(lì)顏色自由可調(diào)性方面非常有利的啟動(dòng)一個(gè)新的挑戰(zhàn)：什么樣的設(shè)備可以喂飽無(wú)級(jí)調(diào)諧到入射的光的熒光顯微鏡的光路中的光？ *簡(jiǎn)單的方法是使用一個(gè)灰色的分束器，但這將是：總是失去態(tài)激發(fā)能的目標(biāo)部分的犧牲 - 盡管這是較小的問題。 這種方法的嚴(yán)重缺點(diǎn)是寶貴的發(fā)射光的損失。 即使使用灰分離器80/20（這將浪費(fèi)的激光能量的4/5）的排放量的五分之一將被犧牲掉。
一個(gè)單一的分色鏡，即使有多個(gè)頻段，顯然不可能支持一個(gè)可調(diào)光源的好處。 一個(gè)單一的排放慢調(diào)諧的一種方法，已經(jīng)商業(yè)化的非連續(xù)光源。 該系統(tǒng)采用了約序列。 10二向色反射鏡，將用于在其工作頻率 - 給只有10種，滿分為200的范圍內(nèi) - 而它們也可用于指定的波長(zhǎng)的兩側(cè)。 這使得一共有30種顏色，但明顯低于**的表現(xiàn)。
這種困境的一個(gè)**的補(bǔ)救辦法是使用聲光。是一種裝置，允許的光路與*過(guò)95％的效率，而頻譜的其余部分被引導(dǎo)到不同的方向，被送入一系列的顏色bandlets。 在一個(gè)多扁帶的可調(diào)諧激光器的情況下，如操作AOBS使得激發(fā)的顏色通過(guò)1級(jí)作為激發(fā)光束路徑的進(jìn)入。
將被有效地傳遞到檢測(cè)路徑的完整的發(fā)射光譜。 線程化所需的在樣品上的激發(fā)扁帶的透射光譜中的空隙的扁帶本身（因?yàn)樗鼈兯a(chǎn)生的相同的技術(shù)）相同的尺寸，同時(shí)可控制在它們的位置：只要一個(gè)曲調(diào)的激勵(lì)顏色，適當(dāng)?shù)钠叫械碾娮诱{(diào)諧相應(yīng)的間隙。 無(wú)需任何操作者的操作是必需的。
的聲光可調(diào)諧分束器，因此*終的耦合裝置，用于可調(diào)諧多色激發(fā)。
激發(fā)和發(fā)射光譜的強(qiáng)度和熒光壽命
光譜檢測(cè)儀（SP）是專為帶寬和完全控制中心檢測(cè)到的發(fā)射譜帶顏色。 這可以保證*高的吞吐量（傳動(dòng)效率高）和*佳分離。作為一個(gè)副作用，SP檢測(cè)器允許記錄的發(fā)射光譜，以及 - （5個(gè)通道）可以同時(shí)或依次（多達(dá)400個(gè)），或這兩種方法以混合模式。 在過(guò)去，被綁定到安裝在系統(tǒng)中的激光器所發(fā)出的幾行的發(fā)光顏色。 隨著白光激光器（WLL），情況已經(jīng)完全改變：顏色1nm的精度可調(diào)，順利激發(fā)譜是整個(gè)可見光譜。 在與SP的檢測(cè)器，它能夠適應(yīng)伺服控制的激發(fā)波長(zhǎng)的組合，這種測(cè)量是完全自動(dòng)進(jìn)行。 它是合理可行的實(shí)施聲光分束器引導(dǎo)激發(fā)和發(fā)射光。
有一個(gè)可調(diào)的勵(lì)磁和一個(gè)可調(diào)諧發(fā)射，下一個(gè)步驟是創(chuàng)建一個(gè)二維的強(qiáng)度相關(guān)的地圖。 這拉姆達(dá)方地圖是特別有用的復(fù)雜混合物的熒光染料時(shí)，需要分開。 這也是一般價(jià)值熒光染料時(shí)，需要的特點(diǎn) - 要么是因?yàn)樗麄兊男掳l(fā)現(xiàn)或設(shè)計(jì)，或者是因?yàn)橛捎谖h(huán)境條件下，感興趣的頻譜改變。
特點(diǎn)是熒光發(fā)射強(qiáng)度和熒光壽命。 要確切衡量壽命，脈沖光源是必需的。 幸運(yùn)的是，白色光的激光是一種脈沖源，脈沖頻率適合的典型的熒光壽命（0.5 ... 5納秒的范圍內(nèi)）的需要。 如果需要更長(zhǎng)的脈沖間隔，脈沖選擇器降低脈沖頻率。 當(dāng)然，白色光可調(diào)諧激光直接呈現(xiàn)終身激發(fā)光譜，包括下一個(gè)合乎邏輯的后果：一個(gè)二維激發(fā)發(fā)射終身地圖。
圖 4：記錄，可將6個(gè)不同顏色的有孔玻璃珠。 左：假色由一個(gè)激發(fā)發(fā)射λ-方掃描記錄，可在有孔玻璃珠的凸起。 右：偽三維視圖的激發(fā)發(fā)光的地圖（熒光橫向）。 人們可以很容易地找到六種不同的熒光染料（箭頭）的峰值。
光門 - 全色電子屏障過(guò)濾器
*后一件事啟用了*新的技術(shù)。 混合探測(cè)器（HyDs）非常敏感，快速，覆蓋一個(gè)大的動(dòng)態(tài)范圍。 他們提供了一個(gè)門控操作模式。 在脈沖白光激光的結(jié)合，它是現(xiàn)在可以只在光脈沖之間的時(shí)間間隔來(lái)檢測(cè)熒光發(fā)射 - 只是由門混合檢測(cè)器的收集沒有在激光脈沖的信號(hào)。 然后，檢測(cè)到的信號(hào)是純熒光，并且不包含任何反射光。 這一做法，剩余反射的顏色對(duì)抗輕松拿下。 有沒有必要限制排放留出了足夠的空間，以激發(fā)顏色集合。 它甚至有可能激發(fā)下方直接測(cè)量 - 和*越，然后允許反斯托克斯發(fā)射特性。
脈沖和光譜可調(diào)白光激光光源，結(jié)合聲光可調(diào)分束器，可調(diào)SP探測(cè)器和門控混合探測(cè)器是一個(gè)巧妙結(jié)合*新的技術(shù)。 而且，雖然這句話聽起來(lái)可能有點(diǎn)穿，它適合在這里：它***的概念和操作共聚焦顯微鏡。
圖 5：通過(guò)門控檢測(cè)，也能夠非常有效地，純粹只記錄從樣品中的熒光。 混合探測(cè)器（HyDs）作為**的傳感器在這方面。 在收集數(shù)據(jù)期間被分配的激勵(lì)脈沖，并因此只有發(fā)射的熒光收集。 左圖：錄制的綠色熒光激發(fā)后，在492 nm處。 排放收集490-600納米。 主信號(hào)的反射光作為激發(fā)波長(zhǎng)為的集發(fā)射頻帶內(nèi)。 右圖：相同的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射集合帶，但光門。 沒有反射光被記錄下來(lái)。 純的和明確的熒光發(fā)射，，不管發(fā)射帶。