尼康顯微鏡：共聚焦顯微鏡的基本概念

比傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡，共聚焦顯微鏡提供了幾個優(yōu)點，包括淺景深，消除焦眩光，以及收集串行光部分的能力，從厚厚的標(biāo)本。 在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中，一個主要的應(yīng)用共焦顯微鏡涉及成像無論是固定的或活的細(xì)胞和組織，通常被標(biāo)記的一個或多個熒光探針。

當(dāng)使用常規(guī)的寬視場光學(xué)顯微鏡，仲由樣品發(fā)出的熒光，出現(xiàn)相差的感興趣區(qū)域的成像熒光樣品往往干擾是在焦點的那些功能的分辨率。 這種情況是特別有問題的樣品具有大于約2微米的厚度。 共聚焦成像的方法提供軸向和橫向分辨率略有改善，但它是從圖像中排除的“焦點”耀斑發(fā)生在厚熒光標(biāo)記標(biāo)本，*近的爆炸已造成儀器的能力在該技術(shù)的普及。 目前大多數(shù)的共聚焦顯微鏡是比較容易操作的，并已成為許多多用戶成像設(shè)施的基本儀器的一部分。 由于未能在激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）的分辨率比在傳統(tǒng)的寬視場光學(xué)顯微鏡比較好一些，但仍大大低于的透射型電子顯微鏡，它具有在某些方面之間的間隙橋接兩個常用技術(shù)。 圖1說明了在一個基本的共聚焦顯微鏡的配置的主要的光通路。

在傳統(tǒng)的寬視場顯微鏡，沐浴在汞或氙光源的光從整個標(biāo)本的圖像可以直接用肉眼觀察或直接投射到圖像捕獲裝置或照相膠片。 與此相反，在共聚焦顯微鏡的圖像形成方法是根本不同的。 的照明是通過掃描一個或多個，通常從激光聚焦光束的光的試樣（圖2），橫跨。 掃描試樣，以這種方式產(chǎn)生的圖像被稱為光學(xué)部分。 這個術(shù)語指的非侵入性的方法，通過該方法的儀器收集圖像，使用聚焦光而不是物理裝置第試樣。

共焦的方法提供了便利有用得多成像的活標(biāo)本，使三維（z系列的）數(shù)據(jù)的自動收集，并改善使用多個標(biāo)簽的標(biāo)本獲得的圖像。 圖3給出了比較傳統(tǒng)的螢光影像碘化丙啶染色的蝴蝶蛹翼上皮整裝類似地區(qū)的共聚焦圖像。 原子核在物流及供應(yīng)鏈管理應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心圖像的分辨率，由于消除焦熒光耀斑有一個顯著的改善。

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）是目前使用*廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用共聚焦變化。 重點是放在在此介紹的激光掃描共聚焦顯微鏡，因為它是*有可能的設(shè)計所可能遇到的新手用戶。 生物成像領(lǐng)域內(nèi)的其他替代設(shè)計的儀器在特定細(xì)分市場的青睞。 試樣制備的協(xié)議可以使用，有輕微的修改，任何共焦儀器變種，以及其他方法生產(chǎn)的光學(xué)部分，如反褶積技術(shù)和多光子成像。

共聚焦顯微鏡的歷史

共聚焦顯微鏡的發(fā)明，通常被認(rèn)為是馬文·明斯基，誰在1955年制作的工作顯微鏡。 共焦方法的發(fā)展主要是由欲望驅(qū)動圖像生物事件發(fā)生，因為他們在生活組織（ 體內(nèi) ），而，明斯基在未染色的準(zhǔn)備工作生活的大腦成像神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的目標(biāo)。 明斯基聚焦成像*，并于1957年獲得**，其原理是受聘于所有現(xiàn)代的共聚焦顯微鏡。 圖1示出共焦原理，采用熒光顯微鏡，這已成為*現(xiàn)代的用于熒光成像的共焦系統(tǒng)的基本配置。 明斯基的原始配置擺在前面的鋯弧源點光源使用的針孔。

光點的物鏡聚焦在試樣所需的焦平面，光通過第二物鏡聚焦在具有相同的焦點作為*個針孔（兩個共焦的第二針孔） 。 不限光通過第二針孔發(fā)生一個低噪聲的光電倍增管，其產(chǎn)生一個信號，從檢體的光的亮度有關(guān)。 第二針孔防止源自到達(dá)光電倍增管中的試樣的焦點平面的上方或下方的光。 使用空間濾波，消除了聚焦光或光暈，比飛機(jī)的焦點是厚的標(biāo)本，聚焦的方法是關(guān)鍵。 在明斯基的著作中，他還描述了反射光顯微鏡，用一個單一的物鏡和二色鏡的安排，成為了目前使用的系統(tǒng)的基礎(chǔ)版本。

為了構(gòu)建一個圖像聚焦原則，聚焦光斑必須以某種方式掃描整個標(biāo)本。 由明斯基在原來的儀器內(nèi)置束保持固定和移動標(biāo)本本身振動階段。 這種安排的優(yōu)點在于，掃描光束的光軸上的顯微鏡，可消除大多數(shù)透鏡的缺陷，從而影響了圖像保持靜止。 然而，生物標(biāo)本，標(biāo)本的運動可引起擺動和失真，從而導(dǎo)致在圖像的分辨率的損失。 此外，它是不可能的注射階段和試樣移動的熒光標(biāo)記的探針，例如在試樣上執(zhí)行各種操作。

無論照射光束進(jìn)行掃描的方法，使整個試樣，試樣的圖像必須出示。 沒有形成一個真正的圖像在明斯基的原始設(shè)計，而是從光電倍增管的輸出被翻譯成圖像在屏幕上的軍事盈余的持效期長示波器有沒有準(zhǔn)備錄音。 繼首張他的發(fā)明，明斯基后來寫道，在他的顯微鏡下的圖像質(zhì)量是不是很令人印象深刻，因為在示波器顯示屏的質(zhì)量并沒有因為取得可憐的分辨率顯微鏡本身。 現(xiàn)在很清楚，技術(shù)不是明斯基在1955年充分展示了共焦方法的潛力，特別是對生物結(jié)構(gòu)成像。 他指出，這可能是一個原因，共聚焦顯微鏡不能立即由生物群落，誰是擁抱，仍然是一個非常苛刻的組，其圖像質(zhì)量。 當(dāng)時，他們有可用的光學(xué)顯微鏡具有優(yōu)良的光學(xué)，并可以很容易地查看和拍攝明亮的彩色和高分辨率彩色薄膜豐富多彩的病理組織切片上。 在今天的激光共聚焦顯微鏡，圖像串行內(nèi)置的光電倍增管的輸出或使用一個裝有電荷耦合器件的數(shù)字相機(jī)，直接處理在計算機(jī)成像系統(tǒng)，一個高的的分辨率的視頻監(jiān)視器上顯示的拍攝，并輸出硬拷貝設(shè)備，以優(yōu)異成績。 信息流在現(xiàn)代激光掃描共聚焦顯微鏡框圖如圖4所示。

光學(xué)顯微鏡的基本光學(xué)系統(tǒng)的幾十年來基本上保持不變，因為儀器所取得的*終分辨率是由光的波長，物鏡和試樣本身的屬性。 對比的標(biāo)本，以及其他相關(guān)的技術(shù)與光學(xué)顯微鏡的方法所使用的染料，在過去的20年里顯著改善。 共焦方法的發(fā)展和完善是一個直接結(jié)果的復(fù)興已經(jīng)在光學(xué)顯微鏡主要刺激的現(xiàn)代科技的進(jìn)步。 明斯基的共焦設(shè)計本來是一個利益的一些重大的技術(shù)進(jìn)步已逐漸成為生物學(xué)家和其他顯微鏡（或更實惠）。 其中有穩(wěn)定的多波長激光為改善點光源，改進(jìn)的雙色鏡，敏感的低噪聲光電探測器，快速增強(qiáng)了可用性，價格實惠的大容量內(nèi)存芯片，*的圖像分析軟件包，以及高分辨率的視頻與圖像處理能力的微型計算機(jī)顯示器和數(shù)字圖像打印機(jī)。

這些技術(shù)的自主開發(fā)，自1955年以來，已逐步納入共聚焦成像系統(tǒng)。 作為一個例子，數(shù)字圖像處理技術(shù)被首次應(yīng)用有效地在20世紀(jì)80年代初由伍茲霍爾海洋研究所的研究人員。 使用他們稱之為“增強(qiáng)視頻顯微鏡”，他們能夠如微管，只是*出了光學(xué)顯微鏡的理論分辨率的圖像蜂窩結(jié)構(gòu)。 分辨率明顯增加，使通過使用光照水平低硅愈演愈烈物鏡（SIT）數(shù)字圖像處理器連接到攝像機(jī)捕獲的圖像的數(shù)字增強(qiáng)。 使用微分干涉相差（DIC）的光學(xué)成像的蜂窩結(jié)構(gòu)，并使用數(shù)字處理方法，進(jìn)一步增強(qiáng)圖像。

的分類，激光共聚焦顯微鏡的設(shè)計通常是試樣進(jìn)行掃描的方法，通過該方法的基礎(chǔ)上。 兩個基本的掃描裝置掃描的階段或照明光束，并且有至少有兩個根本不同的光束掃描的方法。 明斯基原來的設(shè)計是一個階段的掃描系統(tǒng)，這是由一個原始的音叉裝置驅(qū)動，并在建立一個圖象，它是相當(dāng)緩慢的。 現(xiàn)階段掃描共聚焦已經(jīng)從*初的概念設(shè)計，主要用于在材料科學(xué)中的應(yīng)用，如微型芯片業(yè)。 根據(jù)這一原則的系統(tǒng)*近已成為流行在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，涉及微芯片上的DNA篩查。

*成像的生物系統(tǒng)的一個更實際的選擇是掃描的照明束在一個固定的試樣。 這種方法是許多研究顯微鏡，盛行的今天，已經(jīng)演變成系統(tǒng)的基礎(chǔ)。 共聚焦顯微鏡中所涉及的技術(shù)細(xì)節(jié)沒有處理，在此介紹，但基本上是兩種根本不同的光束掃描的方法使用多束掃描和單光束掃描。單束掃描是目前國際上*流行的，是在激光共聚焦顯微鏡使用的方法。 在這里，掃描光束是*常見的通過使用一個幀每秒的速率由電流計驅(qū)動的計算機(jī)控制的反射鏡來實現(xiàn)。 為了實現(xiàn)更快的掃描速度，在附近的視頻幀速率，某些系統(tǒng)中使用的聲光器件，或擺動的反射鏡。 另一種方法使用兩束光的實時掃描，通常依賴于使用某種形式的紡絲尼普科夫盤。 這種系統(tǒng)已經(jīng)被來自串聯(lián)掃描顯微鏡（TSM），與熒光標(biāo)記的樣本采集圖像，使它們更有效率的改進(jìn)。圖5示出這樣一個改進(jìn)的系統(tǒng)，它采用雙尼普科夫盤和微透鏡，以提高檢測的低熒光水平的實時圖像采集。

目前有兩種方法共聚焦顯微鏡在使用用于生產(chǎn)光學(xué)部分：卷積和多光子成像。 他們技術(shù)上的不同，但像聚焦的方法，都是基于傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡。 解卷積算法使用基于計算機(jī)的計算和消除焦熒光圖像信息。 由于更高效的算法和更快的微型計算機(jī)，這種技術(shù)已經(jīng)成為一個實際的成像選項。 多光子顯微鏡使用相同的掃描系統(tǒng)的激光掃描共聚焦顯微鏡，但不要求在檢測器的針孔孔徑。 針孔是不必要的，因為激光激發(fā)熒光染料的標(biāo)簽僅在對焦點，從而消除了out-of-聚焦發(fā)射。 成像的生物體組織中的一個額外的好處是，在試樣中，由于從激光束吸收的能量減少降低光漂白。

傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡形成圍繞其內(nèi)置的激光掃描共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)。 取而代之的是鎢或汞燈，激光作為光源使用，并結(jié)合一個敏感的光電倍增管（PMT）檢測器，和一個計算機(jī)控制掃描反射鏡或其他掃描裝置，以便收集和顯示圖像。 采集后的圖像被存儲在數(shù)字媒體，并且可以分析任何的眾多圖像處理軟件產(chǎn)品的可使用顯微鏡系統(tǒng)的計算機(jī)或第二臺計算機(jī)。

通過激光掃描共聚焦顯微鏡的設(shè)計，照明和探測被限制到一個單一的衍射限制的點在試樣。這一點上的照明帶來集中在試樣通過物鏡，并穿過它，使用某種類型的掃描裝置在計算機(jī)控制下的掃描。 從檢體的光點的序列中檢測由光電倍增管通過一個針孔（或在某些情況下，狹縫），構(gòu)建成一個圖像，并從PMT的輸出由計算機(jī)顯示的。 雖然未染色的試樣從試樣反射回來的光可以被視為使用，他們通常被標(biāo)記為與一個或多個熒光探針。

更多的商業(yè)的成功LSCMs，在文獻(xiàn)中報道1990年左右，發(fā)育生物學(xué)家遇到一個令人困惑的根本問題。 許多免疫熒光標(biāo)記的胚胎內(nèi)部結(jié)構(gòu)和具體的大分子后兩細(xì)胞階段，使用傳統(tǒng)的熒光顯微鏡圖像是不可能的，因為細(xì)胞數(shù)量增加，整體成交量仍然大致相同的胚胎。 這意味著，隨著越來越緊密的包裝細(xì)胞，從任何給定的焦平面還干擾的圖像分辨率，滿分細(xì)胞的熒光增加。

工作的問題上一組研究人員發(fā)現(xiàn)，沒有共聚焦系統(tǒng)時可用的滿足他們的需求。 的時間的技術(shù)，包括掃描顯微鏡，在產(chǎn)生圖像的速度太慢，以約10秒為一個圖像，多光束掃描儀器，這是不實際的熒光成像在那個時候在其發(fā)展階段。 A激光掃描共聚焦顯微鏡設(shè)計，適合常規(guī)熒光顯微鏡，連同其他幾個人在同一時期開發(fā)的精密儀器，生物醫(yī)學(xué)界現(xiàn)已從一些商業(yè)廠商，成為一個先行者。 當(dāng)前可用的系統(tǒng)（尼康E1000）的一個典型例子在圖6中示出。

在開發(fā)的專用儀器，光學(xué)部分的厚度可以變化，通過調(diào)節(jié)在光電檢測器前的直徑的針孔。 相比一些其他的設(shè)計，使用一個固定針孔大小，這種光學(xué)成像生物結(jié)構(gòu)的變化是非常靈活的。圖像可以通過減少試樣在掃描該區(qū)域的面積，并把掃描到的信息進(jìn)行存儲或顯示的數(shù)字陣列相同的大?。ㄒ灶愃频姆绞礁淖兎糯舐实膾呙栊碗娮语@微鏡放大沒有喪失決議）。 做到這一點的能力賦予一個物鏡的倍率范圍內(nèi)，和成像時罕見的或瞬態(tài)事件可能被遺漏或丟失，如果必須改變透鏡的位置，可以是非常有用的。

由于現(xiàn)在可從商業(yè)供應(yīng)商的LSCMs的復(fù)雜性和靈活性，在*近幾年一直在共聚焦顯微鏡的普及了巨大的爆炸，有許多多用戶購買這些工具優(yōu)先電子顯微鏡實驗室。 共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢相對容易地獲得極高質(zhì)量的圖像可以從傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡標(biāo)本準(zhǔn)備，并在其大量的應(yīng)用在許多領(lǐng)域目前的研究興趣。

行之有效的*代LSCMs的固定的標(biāo)本，他們使用從激光的光能量，但非常浪費，往往殺死活標(biāo)本，除非采取非常謹(jǐn)慎，以保持自己的生存能力，同時他們被成像。 盡管有局限性，影像顯微鏡所產(chǎn)生的固定材料是如此之好，生物成像專家聚焦的方法完全接受。 技術(shù)方面做了改進(jìn)，在隨后的幾代儀器的成像過程中的每一個方面。 此外，較新的工具的人體工程學(xué)設(shè)計和可用性的很多改進(jìn)，使之對應(yīng)，改變過濾器的組合，并調(diào)整激光功率，現(xiàn)在通常由軟件控制，更容易，更費時。 現(xiàn)在是可能的圖像同時三個熒光染料，比順序。 的圖像處理階段，也更加發(fā)達(dá)，由于改進(jìn)的，更可靠的軟件，并更迅速地與更多的磁盤存儲空間和更多的計算機(jī)，且成本較低，隨機(jī)存取存儲器。