尼康顯微鏡：熒光顯微鏡原理和結(jié)構(gòu)
由有機(jī)和無(wú)機(jī)樣品的光的吸收，隨后再輻射通常是既定的物理現(xiàn)象作為熒光或磷光的結(jié)果。通過(guò)光的發(fā)射熒光過(guò)程幾乎是同時(shí)地吸收的激發(fā)光的光子的吸收和發(fā)射，取值范圍通常小于一微秒的持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短的時(shí)間之間的延遲。當(dāng)發(fā)射仍然存在更長(zhǎng)的時(shí)間后已經(jīng)熄滅的激發(fā)光，該現(xiàn)象被稱為磷光。
首先描述英國(guó)科學(xué)家Sir George G. Stokes于1852年，是負(fù)責(zé)這一術(shù)語(yǔ)時(shí)，他觀察到的礦物螢石發(fā)出紅光，當(dāng)它被照亮的紫外線激發(fā)熒光。斯托克斯指出，總是發(fā)生在比激發(fā)光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光發(fā)射。在19世紀(jì)早期的調(diào)查表明，當(dāng)用紫外線照射時(shí)，許多標(biāo)本（包括礦物，晶體，樹(shù)脂，生藥，黃油，葉綠素，維生素，和無(wú)機(jī)化合物）熒光。然而，直到20世紀(jì)30年代開(kāi)始使用熒光染料染色的組織成分，細(xì)菌和其他病原體的生物調(diào)查。幾個(gè)這些污漬具有較高的特異性，刺激的熒光顯微鏡的發(fā)展。
熒光顯微鏡技術(shù)在生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)，以及在材料科學(xué)，由于在其他對(duì)比度模式與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡不容易獲得的屬性已經(jīng)成為一個(gè)必不可少的工具。數(shù)組的熒光染料中的應(yīng)用已成為可能，以確定細(xì)胞和細(xì)胞成分亞微觀非熒光材料具有高度的特異性之中。事實(shí)上，在熒光顯微鏡能夠揭示單個(gè)分子的存在下。通過(guò)使用多個(gè)熒光標(biāo)記，不同的探針可同時(shí)識(shí)別多個(gè)物鏡分子同時(shí)進(jìn)行。雖然在熒光顯微鏡不能提供低的空間分辨率的衍射極限的特定試樣的功能，低于該范圍內(nèi)的熒光分子的檢測(cè)，可以容易地獲得。
各種標(biāo)本表現(xiàn)出的自體熒光（不含熒光染料的應(yīng)用），當(dāng)他們被照射，這種現(xiàn)象已徹底在植物學(xué)，巖石學(xué)，半導(dǎo)體產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域的利用。相比之下，動(dòng)物組織和病原體的研究往往是復(fù)雜的，要么極其暗淡或明亮的，非特異性的自發(fā)熒光。更大的值，后者的研究的是，加入的熒光染料（也稱為熒光團(tuán)），特定波長(zhǎng)的光照射被激發(fā)并發(fā)光定義的和有用的強(qiáng)度。熒光染料污漬依附可見(jiàn) 光或子可見(jiàn)的結(jié)構(gòu)，往往是高度特異性的針對(duì)自己的依戀，有一個(gè)顯著的量子效率（比吸收光子發(fā)射）。利用熒光顯微鏡的廣泛增長(zhǎng)是密切相關(guān)的新的合成的和天然的與已知的強(qiáng)度分布的激發(fā)和發(fā)射熒光團(tuán)的發(fā)展，以及很好理解的生物物鏡。
激發(fā)和發(fā)射基本原理
熒光顯微鏡的基本功能是有所需的和特定頻帶的波長(zhǎng)照射試樣，然后分離出更弱的發(fā)射熒光的激發(fā)光。在適當(dāng)配置的數(shù)字顯微鏡，只的發(fā)射光到達(dá)眼睛或檢測(cè)器，使所得到的熒光結(jié)構(gòu)疊加有高對(duì)比度和（或黑色）的一個(gè)非常黑暗的背景。一般的檢測(cè)限受黑暗的背景下，激發(fā)光通常是幾十萬(wàn)到一百萬(wàn)次發(fā)出的熒光亮度比。
在圖1所示的是一個(gè)現(xiàn)代的兩個(gè)發(fā)射和反射熒光顯微鏡落射熒光顯微鏡的剖面圖。在該圖的中心的垂直照明器具有在其一端（標(biāo)記的落射燈箱）和過(guò)濾器立方體炮塔的另一位置的光源。該設(shè)計(jì)包括一個(gè)基本的顯微鏡，其中反射光的反射光的波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)。Johan S. Ploem入賬垂直照明反射光熒光顯微鏡的發(fā)展。在熒光垂直照明，光的特定波長(zhǎng)（或定義的波長(zhǎng)帶），經(jīng)常在紫外，藍(lán)色或綠色區(qū)域的可見(jiàn)光譜，通過(guò)來(lái)自光源的電弧放電燈或其他源通過(guò)一個(gè)多光譜激發(fā)波長(zhǎng)選擇性的過(guò)濾器。通過(guò)激發(fā)光濾光片的波長(zhǎng)反映從一個(gè)二色反射鏡或分束器（也稱為二向色性）的表面上，通過(guò)顯微鏡的物鏡浴中的試樣強(qiáng)烈的光線。如果樣品發(fā)出熒光，通過(guò)由物鏡聚集的發(fā)射光通過(guò)二色鏡，隨后過(guò)濾通過(guò)一個(gè)勢(shì)壘（或發(fā)射）濾波器，該濾波器阻止不需要的激發(fā)波長(zhǎng)。重要的是要注意，熒光試樣，激發(fā)后，產(chǎn)生自己的光在光學(xué)顯微鏡下是*的模式。所發(fā)出的光在所有方向上，球的再輻射的激發(fā)光源方向無(wú)關(guān)。
落射熒光照明是壓倒性的選擇技術(shù)在現(xiàn)代顯微鏡，觀察觀察鏡筒和物鏡轉(zhuǎn)換器殼體的物鏡之間的反射光垂直照明。所述照射器被設(shè)計(jì)為直接光照射到試樣上，首先通過(guò)的激發(fā)光通過(guò)顯微鏡物鏡（在 此配置中，作為一個(gè)聚光鏡）的方式向試樣，然后使用相同的物鏡，以捕獲發(fā)射的熒光。這種類型的照明器具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。作為校正聚光鏡和第二服務(wù)*作為圖像形成的光收集者的熒光顯微鏡的物鏡。作為一種單組分，物鏡/聚光鏡總是**對(duì)齊。達(dá)到試樣的激發(fā)光的大部分通過(guò)無(wú)相互作用，行駛相差的物鏡，和被照射區(qū)域被限制為（在大多數(shù)情況下）通過(guò)目鏡觀察。不像一些對(duì)比增強(qiáng)技術(shù)的情況，全面客觀的數(shù)值孔徑是科勒照明顯微鏡時(shí)，而正確的配置。*后，它是可能的結(jié)合，或交替使用反射光的熒光和透射光觀察和捕獲的數(shù)字圖像。
如在圖1中，反射光垂直照明器包括一個(gè)電弧放電燈管外殼的后端處（通常是一個(gè)汞或氙氣燃燒器）。激勵(lì)光沿垂直照射器，通過(guò)的集電極透鏡和一個(gè)變量，定心的孔徑光闌，然后通過(guò)一個(gè)變量，定心的視場(chǎng)光闌（參見(jiàn)圖1）通過(guò)顯微鏡的光軸。然后，光入射激發(fā)光濾光片選擇所需的波段和不需要的波長(zhǎng)阻塞發(fā)生。所選擇的波長(zhǎng)，通過(guò)激發(fā)濾光片后，達(dá)到的二色性分束鏡，這是一個(gè)專門(mén)的干涉濾光器，可以有效地反射波長(zhǎng)更短的光有效地通過(guò)較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光。二色性分束器在相對(duì)于接收到的激勵(lì)光成45度的角度傾斜時(shí)，這反映了在一個(gè)90度角，直接通過(guò)物鏡光學(xué)系統(tǒng)，和到標(biāo)本的照明。由物鏡收集被照射試樣所產(chǎn)生的熒光發(fā)射，在其通常的圖像形成功能的服務(wù)。因?yàn)樗l(fā)射的光由較長(zhǎng)的波長(zhǎng)比激發(fā)照明，它是能夠通過(guò)二色鏡上方觀察管或電子檢測(cè)儀。
達(dá)到的二色鏡的激發(fā)光的散射反射回光源，雖然分鐘數(shù)量往往穿過(guò)并吸收由反射鏡塊的內(nèi)部涂層。發(fā)出的熒光可以到達(dá)目鏡或探測(cè)器之前，它必須首先通過(guò)通過(guò)屏障或抑制濾波器。該過(guò)濾器塊（抑制）的任何殘余激勵(lì)光，并傳遞所需的較長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)。在大部分的反射光照明裝置中，激發(fā)濾光器，二色鏡，和屏障過(guò)濾器引入到一個(gè)光學(xué)塊（通常稱為作為一個(gè)多維數(shù)據(jù)集），如在圖2中示出。現(xiàn)代熒光顯微鏡能夠容納四至六名熒光的多維數(shù)據(jù)集（通常在一個(gè)旋轉(zhuǎn)的炮塔或通過(guò)滑塊機(jī)構(gòu);見(jiàn)圖1），并允許用戶輕松地將更換售后激發(fā)和屏障過(guò)濾器，以及雙色鏡。
垂直照明設(shè)計(jì)應(yīng)該使用戶能夠調(diào)整顯微鏡科勒照明，提供明亮，均勻的照明，光圈在整個(gè)視野。聚光透鏡的光學(xué)系統(tǒng)的校正應(yīng)確保定心孔徑光闌的圖像共軛的后孔徑集中的物鏡。預(yù)聚焦，定心視場(chǎng)光闌的形象在現(xiàn)代照明，重點(diǎn)標(biāo)本和固定目鏡膜片的平面共軛。
照明燈箱通常采用紅外光抑制濾波器。燈箱本身不會(huì)泄漏有害的紫外線的波長(zhǎng)，優(yōu)選地，應(yīng)設(shè)有一個(gè)開(kāi)關(guān)自動(dòng)關(guān)閉燈泡殼體在操作過(guò)程中不經(jīng)意地打開(kāi)。燈箱應(yīng)該堅(jiān)固，足以承受一個(gè)可能在操作過(guò)程中爆炸燃燒器（弧光放電燈）。燈座在現(xiàn)代燈室的，配備有調(diào)節(jié)旋鈕，以允許中心的弧光燈的圖像內(nèi)的物鏡（科勒照明光學(xué)系統(tǒng)中，這些平面是共軛）的后孔。在光路中，通常接近燈箱和激發(fā)濾光片前的某處，它是試樣時(shí)，不被觀看或與檢測(cè)器成像，以完全阻止激發(fā)光，希望有一個(gè)快門(mén)。此外，中性密度濾光片的規(guī)定應(yīng)當(dāng)提供（無(wú)論是在車輪上，轉(zhuǎn)塔，或滑塊），以使用戶以減少的激勵(lì)照明的強(qiáng)度。
斯托克斯位移
放松當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，振動(dòng)能量損失。的能量損失的結(jié)果，激發(fā)熒光團(tuán)的發(fā)射光譜通常轉(zhuǎn)移至較長(zhǎng)的波長(zhǎng)相比的吸收光譜或激發(fā)光譜（注意，波長(zhǎng)成反比的輻射能量）。這種現(xiàn)象被稱為斯托克斯定律或斯托克斯位移記錄。斯托克斯位移值增加，它變得更容易分離發(fā)射光激發(fā)，通過(guò)使用熒光濾光片組合。
熒光發(fā)射（或吸收）的強(qiáng)度峰值的波長(zhǎng)和幅度比通常較低，所表現(xiàn)出的激發(fā)峰，發(fā)射光譜輪廓（曲線）是通常的鏡像圖像（或接近）的勵(lì)磁曲線，但轉(zhuǎn)移到較長(zhǎng)的波長(zhǎng)，如圖3中所示的Alexa Fluor 555，一個(gè)有用的探針的黃綠色區(qū)域中吸收光，產(chǎn)生橙黃色發(fā)射。通常，為了實(shí)現(xiàn)*大熒光強(qiáng)度，熒光團(tuán)（通常稱為染料）或激發(fā)曲線的峰值波長(zhǎng)附近的激發(fā)，并盡可能廣泛的包括發(fā)光峰的發(fā)光波長(zhǎng)的選擇的檢測(cè)。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的選擇通常是基于干涉濾光器（圖2）。此外，顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的光譜響應(yīng)也將取決于玻璃的傳輸效率（由于防反射涂層），透鏡和反射鏡元件的數(shù)目，和檢測(cè)器系統(tǒng)的響應(yīng)度等因素。
激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的有效分離和檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)在熒光顯微鏡中，通過(guò)適當(dāng)選擇過(guò)濾器，以阻止或通過(guò)特定波長(zhǎng)帶中的紫外線，可見(jiàn)光和近紅外光譜區(qū)。，平衡器）向試樣的方式插入到光路中，并再次在檢體之間的路徑和控制的應(yīng)用，容易地更換過(guò)濾器（中性密度和干擾激發(fā)的激發(fā)光通過(guò)的物鏡而設(shè)計(jì)的熒光的垂直照明器觀察管或相機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)。也許*重要的標(biāo)準(zhǔn)，在相對(duì)低的熒光發(fā)射強(qiáng)度（見(jiàn)上面的討論），是用于激發(fā)光源是足夠的亮度，可以*大化的弱的發(fā)光，并且，熒光染料具有足夠的吸收性能和發(fā)射量子產(chǎn)率。
效率的特定熒光團(tuán)的激發(fā)光的吸收一個(gè)光子的分子橫截面是一個(gè)函數(shù)，被稱為消光系數(shù)和吸收的可能性。更大的消光系數(shù)，在一個(gè)給定的波長(zhǎng)區(qū)域的吸收一個(gè)光子（或量子）是更有可能的。的量子產(chǎn)率表示的量子數(shù)之比，發(fā)射出比吸收（通常是在0.1和1.0之間的一個(gè)值）。低于1的量子產(chǎn)率的值是通過(guò)非輻射的途徑，如熱或光化學(xué)反應(yīng)，而不是重新輻射通路的熒光能量的損失的結(jié)果。消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，平均的光源的發(fā)光強(qiáng)度，熒光壽命的熒光發(fā)射的強(qiáng)度和效用都是重要的因素。
衰退，淬火，漂白
寬譜的條件往往開(kāi)始發(fā)揮作用，*終影響到重?zé)晒獍l(fā)射的輻射，從而降低強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度降低的總稱衰落，一個(gè)包羅萬(wàn)象的所有類別，通常是進(jìn)一步細(xì)分為更精確的描述淬火和漂白現(xiàn)象。光漂白，因?yàn)樗鼈兊南嗷プ饔门c分子氧在發(fā)射前是處于激發(fā)態(tài)的熒光分子的不可逆分解。漂白的發(fā)生被利用的技術(shù)稱為熒光漂白后恢復(fù)（FRAP），一個(gè)非常有用的機(jī)制，為研究生物大分子的擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng)。該方法是基于漂白后大幅定義區(qū)域的標(biāo)本由強(qiáng)烈的激光脈沖，伴隨著隨后的觀察光漂白區(qū)域的熒光恢復(fù)的速率和模式。一個(gè)相關(guān)的技術(shù)，被稱為熒光漂白損失（FLIP），熒光監(jiān)測(cè)減少躺在相鄰的光漂白區(qū)域定義的區(qū)域。類似的FRAP，后者的技術(shù)是有用的在活細(xì)胞中的分子運(yùn)動(dòng)性和動(dòng)力學(xué)調(diào)查。
圖4展示的是光漂白（衰落）中觀察到的一系列為乘法染的文化印度人麂鹿表皮的成纖維細(xì)胞的在不同時(shí)間點(diǎn)拍攝的數(shù)字圖像的一個(gè)典型例子。雙 - 苯并咪唑衍生物（Hoechst 33258，藍(lán)色熒光）的細(xì)胞核進(jìn)行染色，而在線粒體和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架與MitoTracker Red CMXRos（紅色熒光）和鬼筆環(huán)肽衍生物，共聚焦的Alexa Fluor 488（綠色熒光）的染色分別。時(shí)間點(diǎn)在兩分鐘的時(shí)間間隔，用熒光過(guò)濾器組合與調(diào)整，激發(fā)熒光基團(tuán)，同時(shí)也記錄合并發(fā)射信號(hào)帶寬。請(qǐng)注意，所有三個(gè)熒光團(tuán)具有相對(duì)高的強(qiáng)度在圖4（a），但的Hoechst熒光強(qiáng)度（藍(lán)色）開(kāi)始快速下降，在兩分鐘內(nèi)，在6-8分鐘內(nèi)幾乎完全消失了。線粒體和肌動(dòng)蛋白的污漬更耐漂白，但兩者的強(qiáng)度顯著下降的過(guò)程的時(shí)間序列（10分鐘）。
通過(guò)各種機(jī)制涉及非輻射能量損耗和經(jīng)常發(fā)生降低的熒光強(qiáng)度的猝滅結(jié)果激發(fā)態(tài)的弛豫過(guò)程作為氧化劑或鹽或重金屬或鹵素化合物的存在下的結(jié)果。在某些情況下，淬火的能量傳遞到另一個(gè)分子（稱為受體），這是位于物理上接近的激發(fā)的熒光基團(tuán)（供體），這種現(xiàn)象被稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的結(jié)果。這種特殊的機(jī)制，已成為一種有用的技術(shù)，涉及距離遠(yuǎn)低于光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率的分子間的相互作用和關(guān)聯(lián)的研究的基礎(chǔ)。
熒光光源
排放水平低，在大多數(shù)熒光顯微鏡應(yīng)用的一個(gè)不幸后果是，到達(dá)眼睛或相機(jī)探測(cè)器的光子數(shù)也非常低。光學(xué)顯微鏡的收集效率，在大多數(shù)情況下，是小于30％，許多熒光基團(tuán)的濃度在微摩爾或納摩爾地區(qū)范圍的光路中。為了產(chǎn)生足夠的激發(fā)光的強(qiáng)度產(chǎn)生檢測(cè)到的排放量，**的緊湊的光源，如高能量的短弧放電燈，是必要的。*常見(jiàn)的燈的汞的燃燒器，在瓦數(shù)范圍從50至200瓦，氙氣燃燒器，從75至150瓦的范圍內(nèi)（參見(jiàn)圖5）。這些光源通常采用外部直流電源，家具足夠的啟動(dòng)電源，通過(guò)電離的氣態(tài)蒸氣點(diǎn)燃燃燒器，保持它閃爍*低燃燒。
在顯微鏡弧放電燈的外部電源通常是配備一個(gè)帶有計(jì)時(shí)器，跟蹤燃燒器已經(jīng)在運(yùn)行的小時(shí)數(shù)。弧光燈，失去效率和更容易碎裂，如果使用*出其額定壽命（200-300小時(shí)）。汞燃燒器不提供均勻的強(qiáng)度在整個(gè)頻譜從紫外到紅外燈泡的強(qiáng)度大部分花費(fèi)在近紫外。突出強(qiáng)度峰值出現(xiàn)在313，334，365，406，435，546和578納米。在其他波長(zhǎng)在可見(jiàn)光區(qū)域，強(qiáng)度穩(wěn)定，但幾乎沒(méi)有這么亮（但在大多數(shù)應(yīng)用中仍然可用）。在考慮發(fā)光效率，光燈的瓦數(shù)是不是首要的考慮因素。取而代之的是，關(guān)鍵的參數(shù)是必須加以考慮的平均亮度，同時(shí)考慮到發(fā)射源的亮度，弧線的幾何形狀，角度擴(kuò)展。
在過(guò)去的幾年中，光學(xué)顯微鏡經(jīng)歷了增加在應(yīng)用程序中的激光光源，尤其是氬離子，氪氬離子激光器。這些激光源尺寸小，低發(fā)散，近monochromicity，平均亮度高的優(yōu)點(diǎn)。他們已成為在掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)，這種技術(shù)已被證明是一個(gè)**的工具，在渲染非常尖銳的熒光圖像，通過(guò)拒絕非聚焦光除去試樣焦平面至關(guān)重要。通過(guò)點(diǎn)或線重合通過(guò)復(fù)合孔徑成像掃描共聚焦顯微鏡完成這個(gè)任務(wù)。的標(biāo)本的光學(xué)部分可以被存儲(chǔ)在一個(gè)主計(jì)算機(jī)，并重構(gòu)為*終的圖像，然后將其顯示在監(jiān)視器上。
激發(fā)塊術(shù)語(yǔ)
作為一個(gè)結(jié)果，利用由不同的制造商，以確定他們的過(guò)濾器的各種縮寫(xiě)和代碼混亂已成為常見(jiàn)的術(shù)語(yǔ)適用于熒光顯微鏡的功能組合。基本上有三大類過(guò)濾器：激勵(lì)（通常簡(jiǎn)稱為勵(lì)磁），障礙（排放），兩色分光鏡（或分色鏡）。熒光過(guò)濾器以前幾乎完全從染色玻璃或明膠夾在兩個(gè)玻璃板之間的構(gòu)造。然而，目前的趨勢(shì)是制造高清晰度干擾光學(xué)激發(fā)濾光片過(guò)濾器與一個(gè)偉大的特異性和高傳輸?shù)牟ㄩL(zhǎng)的光通過(guò)或拒絕。雙色分光鏡是專門(mén)旨在反映或通過(guò)特定波長(zhǎng)的光時(shí)，放置在一個(gè)45度角（見(jiàn)圖1和圖2）入光路的干擾濾波器。阻擋過(guò)濾器制造與有色玻璃或干擾涂料（或兩者的結(jié)合）。
制造商雇用的縮寫(xiě)識(shí)別激發(fā)濾光片的屬性包括：UG（紫外線玻璃）和BG（藍(lán)色玻璃）。往往表示Shortpass過(guò)濾器KP（K表庫(kù)爾茲，德語(yǔ)的意思是“短”的縮寫(xiě)），或簡(jiǎn)稱為SP。現(xiàn)在，一些制造商的標(biāo)簽指定IF干擾濾波器。窄帶激發(fā)干涉濾光片是特別有用的，如果斯托克斯轉(zhuǎn)變是小。
縮略語(yǔ)或縮寫(xiě)阻隔過(guò)濾器包括：LP或L長(zhǎng)通濾波器，為黃色或蓋爾布（德國(guó)）的玻璃，?或RG紅色玻璃，OG或?橙色的玻璃，K表坎特，德國(guó)術(shù)語(yǔ)邊緣?或GG（過(guò)濾器），以及BA屏障過(guò)濾器。當(dāng)過(guò)濾器的類型也與一個(gè)數(shù)字，如BA515，該指定是指，在50％的它的*大傳輸?shù)牟ㄩL(zhǎng)（納米）。
雙色分光鏡還包括CBS在內(nèi)的眾多縮寫(xiě)所描述的一個(gè)色分束器，DM分色鏡，TK “teiler坎特”，德國(guó)為“teiler FARB” 邊緣分離器，FT（德國(guó)顏色分配器），和RKP反思短傳。所有這些術(shù)語(yǔ)應(yīng)該被認(rèn)為是可以互換的，現(xiàn)代的二色性分束器總是與干擾涂層的光學(xué)玻璃（如有機(jī)或金屬染料相對(duì)）制造的。更長(zhǎng)的波長(zhǎng)更短的波長(zhǎng)和高的傳輸?shù)奈镧R是產(chǎn)生高反射率的薄膜的干擾。二色性分束器在一個(gè)45度角進(jìn)入光學(xué)塊的激發(fā)光，通過(guò)反射光熒光照明器的路徑取向。它們的主要功能是重新定向選擇的激勵(lì)（較短的）波長(zhǎng)通過(guò)物鏡到標(biāo)本。在這些專門(mén)的過(guò)濾器也有通過(guò)較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光發(fā)射的屏障過(guò)濾器，并反映在燈箱的方向的任何散射的激發(fā)光反射回的附加 功能。
圖6給出了一個(gè)典型的熒光現(xiàn)代顯微鏡中使用的過(guò)濾器的組合的傳輸?shù)臋n案。激發(fā)濾光片光譜（紅色曲線）表現(xiàn)出高的水平（約75％），在450和490納米與470納米的中心波長(zhǎng)（CWL）之間傳輸。二色鏡（黃色曲線）反映了在該區(qū)域的激發(fā)光譜的波長(zhǎng)，通過(guò)較高和較低的波長(zhǎng)時(shí)，以相對(duì)較高的效率。需要注意的是0％的透射二色鏡曲線上對(duì)應(yīng)于100％的反射。的突出浸在450和500納米，這表示峰的反射率之間的傳輸特性文件，用于反映通過(guò)在一個(gè)90度的角度，到樣品上的激發(fā)光濾光片的波長(zhǎng)頻帶。中的*終組件的光的列車，排放量或屏障過(guò)濾器（白色曲線），發(fā)射波長(zhǎng)在的綠色可見(jiàn)光區(qū)域，在520和560納米之間的范圍內(nèi)。的各種疊加的光譜的透射和反射的波長(zhǎng)帶之間的界限被設(shè)計(jì)成盡可能陡峭的反射和透射的波長(zhǎng)，以確保幾乎完全分離。正弦上升沿和下降沿尖峰出現(xiàn)在二色鏡光譜的圖案，是一種常見(jiàn)的薄膜沉積過(guò)程被稱為振鈴效應(yīng)。過(guò)濾器組合的表現(xiàn)，這是顯著的，并，實(shí)現(xiàn)薄膜 干涉濾光片技術(shù)的迅速發(fā)展，是一個(gè)明確的示范。
尼康所采用的過(guò)濾器的命名源于條款可以追溯到20世紀(jì)90年代初的混合物。當(dāng)時(shí)，所有的尼康互補(bǔ)濾波器組合使用硬涂層濺射技術(shù)，但許多目前可用的過(guò)濾器利用新型柔軟的涂層方法生產(chǎn)。雖然軟大衣更容易受到濕度和熱降解，且必須更仔細(xì)地處理比硬涂層過(guò)濾器，他們表現(xiàn)出更高的阻擋光密度值，，微調(diào)特定波長(zhǎng)頻帶，并提供更大的方便。了解尼康過(guò)濾器組合代碼命名規(guī)則提供了一種機(jī)制，迅速 確定是否特定的一組特定的熒光將充分履行。
尼康專有的字母數(shù)字濾波器的指定代碼的*個(gè)字母表示的波長(zhǎng)的激發(fā)光譜區(qū)域（例如，UV，V，B，和g，這是簡(jiǎn)單的縮寫(xiě)紫外線，紫色，藍(lán)色，綠色，分別）。激發(fā)后的代碼的數(shù)量涉及激發(fā)濾波器的通帶的寬度：1中和寬的頻帶激勵(lì)的窄頻帶激勵(lì)，2，和3很寬的頻帶激勵(lì)。*后，一個(gè)或多個(gè)字母的激發(fā)帶通大小號(hào)碼標(biāo)識(shí)的屏障過(guò)濾器的特點(diǎn)。代碼字母à表示一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的長(zhǎng)通屏障過(guò)濾器以*低的截止波長(zhǎng)，而乙指定較高的臨界波長(zhǎng)值一個(gè)長(zhǎng)波發(fā)射濾波器的。帶通發(fā)射濾波器中帶有字母的ê（指“增強(qiáng)”），表明其**的性能方面，以消除交叉。E / C濾波器是柔軟的毛發(fā)干擾組合設(shè)計(jì)特異性探針，如DAPI，F(xiàn)ITC，TRITC，州和得克薩斯州紅獲得*佳性能。
螢光預(yù)算
在一個(gè)典型的熒光顯微鏡的光束估計(jì)是有用的概述生產(chǎn)數(shù)字圖像，或在視覺(jué)上觀察標(biāo)本時(shí)會(huì)遇到的約束。在本練習(xí)中，假設(shè)激勵(lì)源，是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的75瓦氙放電燈的平均光通量密度約400坎德拉每平方毫米（其他來(lái)源，見(jiàn)表1）。當(dāng)燈泡的輸出被收集并引導(dǎo)通過(guò)一個(gè)490納米的干涉濾光器（具有10納米的帶寬和75％的透射），約2毫瓦的光通過(guò)。由二色鏡，一個(gè)90％的效率為1.8毫瓦的光束反射后的顯微鏡物鏡作為激發(fā)光束進(jìn)入后孔。
隨著100x物鏡的數(shù)值孔徑為1.4的試樣照明系統(tǒng)的面積將是12×10×E（-6）平方厘米，假設(shè)一個(gè)圓形，直徑約40微米的視圖字段。在試樣上的光束，然后約每平方厘米150瓦，它對(duì)應(yīng)的磁通密度為3.6×10×E（20）每平方厘米的光子。因此，試樣的光照強(qiáng)度是在一個(gè)陽(yáng)光明媚的日子，事件對(duì)地球表面約1000倍以上。
上面所討論的，光束的結(jié)果依賴的熒光發(fā)射的熒光團(tuán)的吸收和發(fā)射特性，它的濃度在試樣和試樣的光路長(zhǎng)度。在數(shù)學(xué)方面，產(chǎn)生的熒光（F）由下式給出：
F =σ×Q×I
其中σ是分子的吸收截面，Q是的量子產(chǎn)率，I是入射光束（按上述方式計(jì)算）。假設(shè)熒光素的熒光團(tuán)的吸收截面（σ）為3×10×E（-16）平方厘米每分子，Q等于0.99，所得的值F的每分子每秒100000光子。如果染料濃度為1微摩爾每升，均勻地分布在40微米直徑的盤(pán)，其厚度為10微米（體積等于12微微升），約1.2×10×E（-17）摩爾的染料或7.2萬(wàn)分子在光路中。如果所有的分子同時(shí)被激發(fā)的熒光發(fā)射率是7.2×10×E（11）的光子每秒（F和數(shù)量的染料分子的商品）。利息問(wèn)題是多少發(fā)出的光子將被檢測(cè)到，上述排放率可以繼續(xù)多久？
選擇光源的發(fā)光密度
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表1
檢測(cè)效率的光的收集效率和檢測(cè)器的量子效率是一個(gè)函數(shù)。甲1.4數(shù)值孔徑以100％的傳送物鏡（一個(gè)不切實(shí)際的條件），有一個(gè)*大的收集效率，大約30％的接受角限制。二色鏡的傳輸效率的屏障過(guò)濾器的85％和80％。全面收集效率約20％或140億光子每秒。如果檢測(cè)器是一個(gè)傳統(tǒng)的電荷耦合器件（CCD），綠色熒光發(fā)射（525納米）的量子效率是50％左右，所以檢測(cè)到的信號(hào)將有70億光子每秒約10％的發(fā)射熒光。即使有一個(gè)**的檢測(cè)器（100％量子效率），只有大約20％的熒光發(fā)射的光子可以被檢測(cè)到。
熒光發(fā)射的持續(xù)時(shí)間依賴于熒光基團(tuán)的破壞率作為漂白結(jié)果。熒光在含氧生理鹽水溶液，測(cè)量結(jié)果表明，每個(gè)分子只能被銷毀之前發(fā)出約36,000光子。在無(wú)氧的環(huán)境中，光破壞的速度減少約10倍，所以每360,000光子熒光分子。整個(gè)染料池，在該示例（720萬(wàn)的分子），然后將能夠產(chǎn)生一個(gè)*小為2.6×10×E（11）及*大為2.6×10×E（12）的光子。假設(shè)上述計(jì)算每個(gè)分子每秒100,000個(gè)光子的發(fā)射率，熒光可能持續(xù)僅0.3?3秒前光破壞。在被檢測(cè)到的光子通量的10％的情況下，為7.2×10×E（10）電子每秒信號(hào)將通過(guò)以下方式獲得。
按照本實(shí)施例的參數(shù)，如果檢測(cè)器是一個(gè)1000×1000像素的CCD相機(jī)，該信號(hào)將被分布*過(guò)一百萬(wàn)的傳感器，每個(gè)傳感器約72,000電子。對(duì)于一個(gè)科學(xué)級(jí)CCD與9微米見(jiàn)方的傳感器，全井的存儲(chǔ)容量大約是80,000個(gè)電子和讀出噪聲小于10個(gè)電子。將在很大程度上取決于該signal-to-noise比等于光子統(tǒng)計(jì)噪聲信號(hào)的平方根，約268。在幾乎所有的情況下，這種高信號(hào)電平只能持續(xù)一個(gè)非常簡(jiǎn)短的一段時(shí)間，光破壞發(fā)生之前。大多數(shù)的顯微鏡利用的妥協(xié)，以延長(zhǎng)觀察期內(nèi)是減少在入射光束的強(qiáng)度，以便只在染料池的熒光團(tuán)分子的一小部分被激發(fā)，并進(jìn)行光破壞。因此，信號(hào) - 噪聲比很少等于理論上的*大值，并通常在熒光顯微鏡中的10和20之間的范圍內(nèi)。
單分子檢測(cè)
在理想的條件下，它往往是未能檢測(cè)到的熒光發(fā)射，其前提是從一個(gè)單一的分子的光的背景和檢測(cè)器的噪聲是足夠低的。正如上面所討論的，單一的熒光分子可能會(huì)釋放出多達(dá)30萬(wàn)的光子被摧毀前漂白。假設(shè)有20％的收集和檢測(cè)效率，約60,000光子將被檢測(cè)到。雪崩光電二極管或電子倍增CCD探測(cè)器，這些實(shí)驗(yàn)中，研究者已經(jīng)能夠監(jiān)控許多秒甚至幾分鐘的單個(gè)分子行為。主要的問(wèn)題是足夠的光抑制背景噪聲。因?yàn)樵S多建設(shè)顯微鏡鏡頭和過(guò)濾器所用的材料顯示某種程度的自體熒光，*初努力朝向非常低的熒光元件的制造。然而，它很快變得明顯，熒光顯微鏡技術(shù)，利用全內(nèi)反射（TIR）低背景和高激發(fā)光通量提供所需的組合。
全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM）利用漸逝波，所開(kāi)發(fā)的光時(shí)，具有不同的折射率的兩種介質(zhì)之間的界面處的全內(nèi)反射。圖7（a）中示出的原理，采用外部光源。在這種技術(shù)中，光束的光（通常是一個(gè)擴(kuò)展的激光束）被引導(dǎo)通過(guò)棱鏡的折射率高，如玻璃或藍(lán)寶石，緊靠低折射率介質(zhì)的玻璃或水溶液。如果光被引導(dǎo)到以高于臨界角的棱鏡，光束將被全內(nèi)反射的界面處。反射現(xiàn)象的發(fā)展的界面處滲透到約200納米或更小的折射率低的空間的電磁場(chǎng)產(chǎn)生的漸逝波。倏逝波的光的強(qiáng)度足夠高內(nèi)激發(fā)出熒光，但由于其深度較淺，興奮的是非常小的體積。因?yàn)檫@么少的試樣接觸到的激發(fā)光（只有這部分的接口內(nèi)的200納米的距離），其結(jié)果是一個(gè)非常低的電平的背景。
也可以通過(guò)落射照明的變形進(jìn)行全內(nèi)反射熒光顯微鏡接近利用寬視場(chǎng)技術(shù)（圖7（b）中示出）。此方法需要一個(gè)非常高的數(shù)值孔徑的物鏡（至少為1.4，但優(yōu)選為1.45?1.6）和從一個(gè)側(cè)面部分的顯微鏡視場(chǎng)照明由一個(gè)小的運(yùn)動(dòng)或由薄環(huán)的更均勻的照明。高折射率透鏡的液浸介質(zhì)和顯微鏡蓋玻璃需要實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射造成的照明角度。圖7（b），退出物鏡前透鏡元件的光的角度小于臨界角（記為A（1） ）在圖7的（b））中提出的傳輸相差顯微鏡。當(dāng)增加或*過(guò)臨界角的角度（表示角度A（2）在圖7（b）），全內(nèi)反射的結(jié)果。
其他流行的*的熒光技術(shù)，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和熒光漂白后恢復(fù)（FRAP），以及光譜，往往是結(jié)合與內(nèi)部全反射來(lái)實(shí)現(xiàn)額外的信息。其結(jié)果是一個(gè)非常**的工具，研究個(gè)別熒光基團(tuán)和熒光標(biāo)記分子。從研究單個(gè)分子的性質(zhì)所產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)才剛剛開(kāi)始被贊賞。因此，現(xiàn)在光學(xué)顯微鏡的電流范圍從單分子延伸到整個(gè)動(dòng)物。
結(jié)論
現(xiàn)代熒光顯微鏡結(jié)合的高性能光學(xué)元件與電源計(jì)算機(jī)控制儀器和數(shù)字圖像采集到實(shí)現(xiàn)的復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)*過(guò)簡(jiǎn)單的觀察到人的眼睛。電子成像顯微鏡現(xiàn)在在很大程度上取決于在低光照水平或在視覺(jué)檢測(cè)不到的波長(zhǎng)快速獲取信息。這些技術(shù)上的改進(jìn)不是單純的門(mén)面，但是光鏡下作為一個(gè)系統(tǒng)的重要組成部分。
光學(xué)顯微鏡時(shí)，純粹是描述性的工具或智力玩具的時(shí)代已經(jīng)過(guò)去。目前，光圖像形成的是數(shù)據(jù)分析的*步。在顯微鏡來(lái)完成結(jié)合的電子檢測(cè)器，圖像處理器和顯示設(shè)備的成像系統(tǒng)的擴(kuò)展，可以被看作是這*步。電腦控制的焦點(diǎn)，舞臺(tái)上的地位，光學(xué)元件，百葉窗，過(guò)濾器，和探測(cè)器是在廣泛使用和使力所能及的機(jī)械顯微鏡實(shí)驗(yàn)操作。在熒光顯微鏡中的電子光學(xué)系統(tǒng)的應(yīng)用越來(lái)越普遍，導(dǎo)致能夠操縱亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或顆粒，單分子成像，和復(fù)雜的光譜應(yīng)用廣泛的光鑷的發(fā)展。