徠卡顯微鏡：膜片鉗技術(shù)
特別是在神經(jīng)科學(xué)，生理的離子通道一直感興趣的主要話題。膜片鉗技術(shù)的發(fā)展，20世紀(jì)70年代中后期，電生理學(xué)家新的前景。它允許高精度電流錄音不僅整個(gè)細(xì)胞，同時(shí)也切除蜂窩補(bǔ)丁。即使單通道開(kāi)幕活動(dòng)進(jìn)行調(diào)查。然而，由于其復(fù)雜的技術(shù)，物理和生物的背景中，需要高靈敏度的設(shè)備和實(shí)驗(yàn)者所需量龐大的技能，電仍然是在實(shí)驗(yàn)室的日常工作中*具挑戰(zhàn)性的方法之一。
圖 2：使用相位對(duì)比圖像的補(bǔ)丁吸管連接到一個(gè)培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元的細(xì)胞膜。德國(guó)波鴻魯爾大學(xué)，阿瓜多Ainhara博士的禮貌
配置
根據(jù)不同的研究興趣，不同的配置都可以使用。在細(xì)胞貼附模式膜修補(bǔ)程序保持不變（圖3）。的修改的細(xì)胞連接模式是松散的膜片。在這種情況下，移液管沒(méi)有緊密地密封的膜，但僅松散地連接到它。此模式通常用于記錄神經(jīng)細(xì)胞的動(dòng)作電位的。它的優(yōu)點(diǎn)是不影響組合物的細(xì)胞質(zhì)。然而，另一方面，不能被控制的細(xì) 胞內(nèi)環(huán)境。
成孔劑（通常是抗生素）應(yīng)用通過(guò)補(bǔ)丁吸管的查詢結(jié)果中的穿孔膜片保證離子的連續(xù)性，但是，保證電極內(nèi)液，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，不洗滌。*常用的膜片鉗模式是全細(xì)胞模式（圖3）。要實(shí)現(xiàn)這一模式，膜修補(bǔ)程序被打亂通過(guò)短暫申請(qǐng)吸力強(qiáng)勁。的移液管的內(nèi)部，成為連續(xù)的細(xì)胞質(zhì)中。這個(gè)方法是用來(lái)記錄從整個(gè)細(xì)胞的電勢(shì)和電流。在全細(xì)胞測(cè)量的研究人員可以選擇兩種配置之間的電壓鉗位電壓保持恒定和電流記錄模式，在該模式下，或其中電流被保持恒定的電流鉗模式和中膜電位的變化可以得到遵守。
此外，它也可以只從一個(gè)小的補(bǔ)丁，而不是整個(gè)細(xì)胞記錄電流。這就提出了一個(gè)記錄單一渠道的機(jī)會(huì)。補(bǔ)丁可定向補(bǔ)丁吸管內(nèi)的兩個(gè)不同的方向。為了實(shí)現(xiàn)內(nèi)到外的配置的補(bǔ)丁吸管連接到細(xì)胞膜和，然后縮回折斷一小片膜（圖3）。在這種情況下，胞漿膜表面的露出。這通常被用來(lái)進(jìn)行調(diào)查的暴露于細(xì)胞內(nèi)表面的介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是，可以進(jìn)行修改，單個(gè)信道的活動(dòng)。
如果物鏡是研究線索，如神經(jīng)遞質(zhì)的影響外，外配置（圖3）應(yīng)選擇。在這種情況下的移液管在全細(xì)胞配置縮回，導(dǎo)致膜的斷裂和重排。在此配置中，細(xì)胞外表面暴露，從而可以很容易地應(yīng)用于細(xì)胞外線索。
圖 3：四個(gè)膜片鉗記錄方法：細(xì)胞貼附：當(dāng)吸液管是在*接近細(xì)胞膜，溫和的吸力被施加到獲得移液管和膜之間的緊密的密封。全細(xì)胞：通過(guò)應(yīng)用另一個(gè)簡(jiǎn)短，但吸力強(qiáng)勁，細(xì)胞膜破裂和吸管進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)。內(nèi)到外的：在細(xì)胞貼附模式，移液管收縮和修補(bǔ)程序是分開(kāi)的膜的其余部分，并暴露在空氣中的。的細(xì)胞質(zhì)的膜表面被暴露。外：在全細(xì)胞模式，導(dǎo)致兩小塊膜重新連接并形成一個(gè)小泡狀結(jié)構(gòu)與細(xì)胞質(zhì)面朝內(nèi)液吸管縮回。
要求
膜片鉗實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞，急性分離細(xì)胞或急性vibratome的片，它允許在自然環(huán)境中細(xì)胞的電生理特性的調(diào)查。感興趣的離子通道也可以在一個(gè)共同的細(xì)胞系（如HEK293，CHO，LNCaP細(xì)胞）進(jìn)行分離和異質(zhì)性表達(dá)。
根據(jù)樣品的，無(wú)論是一個(gè)倒置的（培養(yǎng)細(xì)胞）或需要一個(gè)直立的固定載物臺(tái)的顯微鏡（片）與一個(gè)穩(wěn)定的平臺(tái)。如果急性切片的細(xì)胞進(jìn)行了研究，紅外DIC建議可視化膜。應(yīng)放置在顯微鏡上防振表可能是致命的，因?yàn)槿魏我苿?dòng)的移液管和膜之間的密封。
顯微需要精確移液管。形成很細(xì)的移液管，通過(guò)加熱和拉小的玻璃或石英毛細(xì)管。吸液管**的直徑為1微米左右，封閉膜修補(bǔ)程序，其中包含只有少數(shù)或者甚至只是一個(gè)離子通道。移液管的**熱拋光獲得的高電阻膜的密封件壓在微段。充滿了一個(gè)解決方案，或者類似的細(xì)胞外溶液或細(xì)胞質(zhì)中，根據(jù)在記錄模式下的移液管。吸移管被安裝在顯微向細(xì)胞膜，以允許精確的動(dòng)作。
使用氯化銀線的電流的電導(dǎo)。將染液的電極，這也是一種氯化銀焊絲，設(shè)定的電流值為零。一個(gè)低噪聲晶體管差分放大器連接到計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和數(shù)字化。可以購(gòu)買(mǎi)特定的軟件來(lái)控制的放大器和分析數(shù)據(jù)。一個(gè)示波器也可以用于監(jiān)視的電流。如果需要，可以添加灌注系統(tǒng)的設(shè)置。物質(zhì)可以被應(yīng)用通過(guò)灌注鉛筆或通過(guò)使用一個(gè)POC（灌注開(kāi)式和閉式）室。
應(yīng)用
膜片鉗實(shí)驗(yàn)中被用來(lái)接近生理問(wèn)題，種類繁多的，不僅在神經(jīng)科學(xué)。在過(guò)去的二十年期間，膜片鉗記錄也變得越來(lái)越重要，在非興奮細(xì)胞離子通道的調(diào)查。這也是一個(gè)很重要的方法在醫(yī)學(xué)研究中，因?yàn)樵S多疾病都與確定的離子通道的故障。藥理研究，自動(dòng)化膜片鉗是用來(lái)篩選烈性物質(zhì)的離子通道修改。
膜片鉗記錄，也可以結(jié)合如Ca 2 +成像與活細(xì)胞成像方法。在這種情況下的Ca 2 +敏感的熒光染料被施加到通過(guò)補(bǔ)丁吸管細(xì)胞。同時(shí)記錄膜電流的熒光變化。pH值或Cl -敏感的染料，可以進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。
圖 1：基本原理膜片鉗記錄。含有電解液的玻璃移液管緊密地密封到細(xì)胞膜上，從而電隔離膜補(bǔ)丁。熔劑通過(guò)通道中的電流，因此，在此修補(bǔ)程序的移液管的流入，可記錄的電極，其連接到差分放大器的一個(gè)高度敏感的。在電壓鉗位配置中，電流被注入到細(xì)胞中，通過(guò)負(fù)反饋回路補(bǔ)償膜電位的變化。錄制該電流使膜電導(dǎo)的結(jié)論。
歷史背景
路易吉·伽伐尼的開(kāi)拓性工作的18 個(gè)世紀(jì)和工作的埃米爾·杜Bois-REYMOND的，約翰內(nèi)斯·彼得·米勒和赫爾曼·馮·亥姆霍茲的19 世紀(jì)開(kāi)始，細(xì)胞膜和細(xì)胞興奮始終重大利益進(jìn)行研究，對(duì)神經(jīng)的系統(tǒng)。艾倫·勞埃德·霍奇金淋巴瘤和安德魯·赫胥黎于1952年揭示了離子通道的動(dòng)作電位的事件，使用的電壓鉗技術(shù)，并于1963年被授予諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的杰出工作。
在這個(gè)時(shí)候，只能施加的電壓鉗位到相當(dāng)大的細(xì)胞，作為尖銳的微電極，需要穿透細(xì)胞膜。在20世紀(jì)70年代后期，伯特索克曼和埃爾溫·內(nèi)爾精致的電壓鉗技術(shù)，并*次跨越的青蛙骨骼肌膜補(bǔ)丁解決了單個(gè)通道電流。他們還榮獲了諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（1991年）。下一個(gè)突破是發(fā)明于1980年由恩斯特索克曼千兆密封，極大地提高了信號(hào)噪聲比，并允許更小的電流記錄。
電，率先在特殊的生物物理實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)在已經(jīng)擴(kuò)大到基本的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究，并成為在神經(jīng)系統(tǒng)中的單個(gè)細(xì)胞或整個(gè)蜂窩網(wǎng)絡(luò)的行為進(jìn)行調(diào)查的*重要的工具之一。
基本原理
膜片鉗技術(shù)允許一小甚至單離子通道的調(diào)查。因此，它是特殊的興奮細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞，心肌細(xì)胞和肌肉纖維的研究興趣。
單離子通道進(jìn)行每秒約10億離子。然而，電流只有幾皮安。記錄在這個(gè)量級(jí)的電流是相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性，不僅為研究員，同時(shí)也為設(shè)備。原則上，薄板玻璃或石英一鈍頭的移液管被密封到膜（圖2，3）。
吸入被施加到輔助密封在千兆歐姆范圍內(nèi)的高電阻的發(fā)展。這種緊密的密封電隔離膜補(bǔ)丁，表示所有助熔劑膜補(bǔ)丁的移液管流入的離子，并記錄由氯化銀電極連接到一個(gè)高度敏感的電子放大器。浴電極是用來(lái)設(shè)置為零電平。
為了防止在膜電位的改變，類似于通過(guò)膜流動(dòng)的電流所產(chǎn)生的機(jī)制（圖1）作為一個(gè)負(fù)反饋放大器的補(bǔ)償電流。
細(xì)胞的膜電位的測(cè)量和相比，命令潛力。如果有命令潛力和測(cè)量之間的差異，將被注入的電流。這種補(bǔ)償電流將被記錄，并允許膜電導(dǎo)的結(jié)論。膜電位可以被操縱獨(dú)立的離子電流，這使得膜通道的電流 - 電壓關(guān)系的調(diào)查。
