尼康顯微鏡：熒光共聚焦顯微鏡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)
我們都知道，熒光顯微照片顯示的位置在一個組織的標(biāo)記分子，對嗎？好吧，也許不是。事實上，所有你可以的真的確定測量與大多數(shù)激光掃描共聚焦顯微鏡，熒光模式是在一個特定的時間收集的光子數(shù)量的某些功能。我們希望這是一個準(zhǔn)確的衡量一個或兩個有趣的參數(shù) - 本地物濃度或當(dāng)?shù)氐碾x子濃度。事實上，許多因素會影響實際存儲在計算機(jī)內(nèi)存中，在任何給定時刻的數(shù)值。
甲圖1中所示的流程圖的一個通用的激光掃描共聚焦顯微鏡，示出一個數(shù)字“39”在文中提到的功能的位置。所示的系統(tǒng)是基于一個倒置的光學(xué)顯微鏡，其被配置為活細(xì)胞成像。在下面的文本稱為單個組件被標(biāo)記為圖中的（a）至（克）以字母。該圖包括三個光學(xué)部分，在不同的高度，沿Z軸方向通過抗體標(biāo)記的果蠅胚胎，指定為Z1，Z2，Z3的。
多年來，學(xué)生采取立體顯微鏡活細(xì)胞當(dāng)然每年六月舉行的加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)，編制了一份清單，這些外來因素。在*年，增長到39個條目的列表，所以我們借用希區(qū)柯克電影的名字，我們的名單上。此后，名單繼續(xù)成長！（在球場上的更多信息，可以發(fā)現(xiàn)在網(wǎng)絡(luò)上的3-D顯微鏡課程布告欄）。
這篇文章雖然不能完全形容每學(xué)期，簡潔和有用的解釋。出現(xiàn)的條款與其他條款粗體字粗體字和許多互動。請注意，這些變量通常被認(rèn)為是影響空間分辨率。因為降低分辨率轉(zhuǎn)換成“把相同數(shù)量的令人興奮的光子成一個較大的現(xiàn)貨”，他們在這里列出。這降低了激發(fā)光強(qiáng)度 - 一個給定的分子所產(chǎn)生的光子的數(shù)量 - 和小部分，被檢測到的這些。人們常常忘記，熒光共聚焦顯微鏡的正常信號電平對應(yīng)的*亮區(qū)域只有10-20光子/像素。在這樣的條件下，統(tǒng)計噪聲，是一個重要的限制的空間分辨率比由阿貝方程定義：
在公式中，dmin表示在一個周期光柵，剛好可以分辨出來的*小間距，和被表示為在試樣空間的橫向距離; λ0是光在真空中的波長，NAobj和NAcond的目的和聚光透鏡的數(shù)值孔徑，分別。方程式建立的目的和聚光鏡的數(shù)值孔徑，對于一個給定波長的光，在確定圖像分辨率的作用。
激光單元（圖1（a））是照明源，并在一般情況下，所測得的熒光的激光功率電平成比例。雖然通常調(diào)節(jié)激光輸出功率的總計，在每一行的多行的激光的功率量可能不會是，隨著時間的推移可能在很寬的范圍內(nèi)變化。的波長會影響光學(xué)性能，通過染料的吸收光譜，確定產(chǎn)生的熒光的量。
輸出功率不穩(wěn)定往往是噪聲，它的不穩(wěn)定通常是不到1％，但激光器可以變得越來越不穩(wěn)定，因為他們的年齡。由于灰塵，未對準(zhǔn)，或機(jī)械不穩(wěn)定性可能會導(dǎo)致隨機(jī)變化的10％-30％，連接光纖的光耦合的效率（如果使用的話）是至關(guān)重要的。
對準(zhǔn)激光反射鏡和反射特性可以是源長期漂移激光輸出。由于是由激 光反射鏡的激光源，束指向誤差和/對齊是重要的。的不穩(wěn)定性在這里將顯示為亮度變化，因為在視在源的位置的變化將改變耦合到大多數(shù)儀器中使用的單模光纖中的激光的光學(xué)系統(tǒng)的效率。
物鏡的數(shù)值孔徑（圖1（b））的影響由樣品發(fā)射的光，可以收集到的餾分。從激光的光，這也是真實的。
物鏡放大倍率的物鏡入射光瞳的直徑成反比關(guān)系。物鏡才會正常運(yùn)作，如果整個入瞳充滿了令人興奮的激光。底部填充會降低空間分辨率和強(qiáng)度的峰值。載入過多會導(dǎo)致，一些激光光線射入金屬安裝的目的和丟失，也降低了強(qiáng)度當(dāng)場。
清潔度是很重要的，臟的光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生更大和調(diào)光的斑點。 隨波長變化的變速器（小部分入射的光，可以集中到一個點上，它的另一側(cè)上的物鏡）。小心使用一些相對較新，在紅外范圍內(nèi)的多層光學(xué) 色和球面像差都使斑點較大，并且隨波長而異。此外，球面像差與蓋玻片的厚度和折射率的浸泡和嵌入介質(zhì)強(qiáng)烈變化。
衍射的光學(xué)分辨率限制是不可避免的。它可以有效地擴(kuò)大小于衍射極限的物體的形象，使他們比他們應(yīng)該顯得暗淡。
掃描系統(tǒng)（圖1（c）），特別是變焦倍率的控制，確定試樣處的像素的大小。奈奎斯特采樣，像素應(yīng)該是至少2倍小于*小的功能，你希望看到在你的標(biāo)本。假設(shè)瑞利判據(jù)200納米的分辨率，像素應(yīng)該是小于100納米。較大的欠生產(chǎn)，減少記錄的亮度小的特點。
漂白率的影響，變焦倍率的平方成正比。至于掃描速度，時間越長，在一個特定的像素停留時間，更多的信號將被檢測到的越少，它會被扭曲的泊松噪聲。在高掃描速度（小于100毫微秒/像素），信號來自染料，熒光衰減常數(shù)，比這更長的停留時間可減少。
光柵尺寸 -在變焦倍率一起，沿著柵格的邊緣的像素的數(shù)目將確定的像素大小。更多的像素（1024×1024相對于512×512）使欠的可能性較小，但意味著必須在每個像素上花費(fèi)更少的時間，收集的光子的數(shù)量減少，增加泊松噪聲，或更多的時間來掃描放大圖像和可能導(dǎo)致更加漂白。的光學(xué)元件或掃描鏡可以引入對象的形狀和圖像之間的不一致，可能導(dǎo)致的幾何畸變。環(huán)境是很重要的：振動和雜散電磁場可引起多種設(shè)備，例如，冷卻風(fēng)扇。這些可能會造成鏡不當(dāng)，導(dǎo)致扭曲變形，可能會隨時間而改變。
其他的光學(xué)系統(tǒng)包括傳輸，它描述了一定程度的吸收和反射損失的情況下，在光學(xué)元件，特別是中性密度或帶通濾波器，分束器和物鏡空氣/玻璃界面的 反射通常代表丟失的信號，但可能出現(xiàn)無關(guān)的亮點。標(biāo)本結(jié)構(gòu)。 鏡子反射紅外線和紫外線的波長可以是一個**的功能，降低濕度和灰塵暴露。
蓋玻片的厚度是*昂貴的光學(xué)元件，*有可能被不小心選擇。它應(yīng)該是170±5微米的厚度。至于浸油，其折射率必須精確匹配所使用的物鏡。這可能只發(fā)生在一個小的溫度范圍內(nèi)，或者，也可以是自定義混合。的聚焦平面的位置是很重要的，因為一個特征略高于或低于對焦平面比的焦點的平面中的功能，會出現(xiàn)調(diào)光器。收集三維數(shù)據(jù)時，還必須實行奈奎斯特采樣的z平面的間距。*后，機(jī)械漂移的載物臺，可能會導(dǎo)致實際的對象平面的成像隨著時間而改變。
感興趣的染料的濃度可能是你正試圖測量 滲透到（或空間排阻）標(biāo)本往往是離子強(qiáng)度和pH的函數(shù)。吸收截面是由染料分子將被吸收的激動人心的光子通量的分?jǐn)?shù)的測定。它的共軛探頭，pH值，特定的離子濃度，離子強(qiáng)度的影響的方法。
量子效率描述了從一個令人興奮的光子吸收的能量將被重新作為熒光光子輻射的機(jī)會。它是一種強(qiáng)的波長的函數(shù)，還受pH值，離子濃度，離子強(qiáng)度和染料-蛋白質(zhì)相互作用。 發(fā)生單線態(tài)飽和，大于一毫瓦的激光功率時，使用具有高數(shù)值孔徑的物鏡。然后，光的強(qiáng)度足以將大部分的染料分子接近交叉成激發(fā)態(tài)，有效的減少了染料的量子效率。
裝載是指你投入你的手機(jī)的染料量。重要的變量包括的染料分子的數(shù)目/抗體或其它蛋白質(zhì)標(biāo)記，和協(xié)議，用于固定/通透 淬火附近的其他人從一個染料分子發(fā)出的熒光的吸收。 卸載是指染色，在細(xì)胞中，但現(xiàn)在已經(jīng)被抽出，或以其它方式失活。
基材反應(yīng)率，適用于染料的熒光性質(zhì)，他們在細(xì)胞的離子或其它分子的相互作用有關(guān)。像素住的微秒的量級，所以有可能沒有足夠的時間，以達(dá)到平衡。 Prebleaching指漂白的染料在本測定之前。
條塊的再分配是由細(xì)胞內(nèi)過程的染料， 染料/染料的相互作用不僅指淬火剛才提到的，而且熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。出現(xiàn)這種情況時的發(fā)射光譜的第二個染料分子的吸收光譜，相差幾納米的一種染料重疊。 FRET可以導(dǎo)致只是在第二染料的發(fā)光波長的光的發(fā)射。通常情況下，如果第二個分子中沒有熒光，熒光丟失或驟冷。在試樣上的影響，染料可能會影響許多環(huán)境變量包括試樣的可行性的惡化。
試樣的折射率（圖圖1（d））和其包埋劑將確定存在的球面像差的嚴(yán)重程度。即使觀賞水生物標(biāo)本使用水物鏡，本場比賽是不可能是**的，甚至是貼身。此類型的球面像差的信號損失的增加穿透深度是主要原因。
用正確的折射率和色散（折射率隨波長的變化），重要的是使用浸油。此外，請務(wù)必將作為浸泡介質(zhì)中的鏡頭有沒有氣泡。檢查通過集中向上和向下伯特蘭透鏡用于調(diào)整你的相位環(huán)。
試樣的至關(guān)重要的狀態(tài)可能會影響的實驗結(jié)果的，因為，例如，死亡的細(xì)胞有不同的形狀，大小和比活的離子環(huán)境。 自發(fā)熒光是指內(nèi)源性熒光化合物的存在下。這些分子的效率可能會發(fā)生變化，pH值，離子濃度，代謝狀態(tài)。附加的自體熒光，可通過將不正確的固定，特別是當(dāng)使用戊二醛。
折射結(jié)構(gòu)或細(xì)胞器之間的物鏡和焦點的平面，例如，外球面球脂質(zhì)，重新聚焦光束到一個完全陌生的位置。較小的特點，可能有較小的影響，但出的光束的散射光強(qiáng)度降低激發(fā)點，因此，檢測到的信號的折射功能。其累積效應(yīng)也具有遠(yuǎn)高于水的折射率的細(xì)胞。
聚焦平面的上方或下方的高度染色的結(jié)構(gòu)的存在或不存在于z分辨率是有限的。大型結(jié)構(gòu)還可以吸收大量的興奮的光芒，如果高度染色。
的信號，通過針孔（圖第1（e））的針孔（或大小），這是通常被設(shè)置為等于艾里斑的直徑的平面的直徑的平方成正比針孔 對齊是重要的，應(yīng)與針孔的中心重合的圖像的激光聚焦到樣品上，然后通過光學(xué)系統(tǒng)重新聚焦回。
該檢測器（圖1（g））通常是一個光電倍增管（PMT）。檢測到的信號是成正比的量子效率。實際的*共焦的工具中使用的光電倍增管的量子效率從約15％下降到約4％，在光譜的紅端的藍(lán)色端。至于響應(yīng)時間：大多數(shù)熒光信號可以迅速放大，但其他國家，如跨膜電流探測器，響應(yīng)速度很慢，慢掃描速度必要。
的PMT電壓決定了擴(kuò)增的PMT。增加了50伏對應(yīng)至約兩增益的一個因素。要注意的是光電倍增管的黑電平（亮度）控制允許的任意一個提出的數(shù)字化儀從信號量的加法或減法。應(yīng)設(shè)置的黑電平中的*暗部分的圖像，使該信號電平是5-10的數(shù)字單元。
有許多可能的噪聲源，都將扭曲的入賬價值。通常情況下，光電倍增管產(chǎn)生的暗電流噪聲，是比較小的信號電平。然而，這同樣允許成為溫水或觀看時光線染色標(biāo)本對紅色敏感的光電倍增管。除了 從任何雜散光，可能無意中達(dá)到的PMT，剩下的主要噪聲源是泊松噪音或統(tǒng)計。這是等于記錄，可在給定的像素的光子數(shù)的平方根。其結(jié)果是，在較高的信號電平變大，即使信號與噪聲的比率提高。
數(shù)字化中，通常使用一臺計算機(jī)（圖1（g））應(yīng)該是線性的。數(shù)字轉(zhuǎn)換器的“8位”顯微鏡的電子信號必須是要被記錄在1和255之間的尺寸。由于噪聲統(tǒng)計，10和220之間的值，是更安全。數(shù)字轉(zhuǎn)換因子是指檢測到的光子的數(shù)目和存儲的號碼之間的比率。這取決于對光電倍增管的電壓和其他的電子增益，但通常為約30正常標(biāo)本記錄，可對8位工具。
記住，要準(zhǔn)確地測量這些因素之一，一個人必須持有其他38個常數(shù)。祝你好運(yùn)！
dmin = λ0 / (NAobj + NAcond)